使用 卤虫 盐L的致死性生物测定。

摘要

这项工作旨在评估和审查 卤虫 盐碱致死性生物测定程序，也称为盐水虾致死性测定。这种简单而廉价的方法提供了有关样品（即天然产物）的一般毒性（被视为初步毒性评估）的信息。

摘要

天然产物自古以来就被用来生产药物。如今，有很多化疗药物从天然来源获得并用于治疗多种疾病。不幸的是，这些化合物中的大多数通常表现出全身毒性和不良反应。为了更好地评估所选潜在生物活性样品的耐受性，盐水虾（盐卤菌）通常用作致死率研究的模型。 A. salina 测试基于所研究的生物活性化合物在其幼虫阶段（无节幼体）杀死微甲壳类动物的能力。该方法是细胞毒性研究以及合成、半合成和天然产物的一般毒性筛选的便捷起点。与通常用于上述目的的许多其他测定（体外 细胞或酵母菌株，斑马鱼，啮齿动物）相比，它可以被认为是一种简单，快速和低成本的测定;此外，即使没有任何特定培训，也可以轻松执行。总体而言， A. salina 测定是所选化合物的初步毒性评估和天然产物提取物的生物引导分馏的有用工具。

引言

多年来，来自植物、动物或微生物的天然产物因其生物和药理活性的多样性而成为开发新的^{生物活性分子}的一个日益受到关注的领域1。然而，相关的副作用、耐药性或药物的特异性不足，特别是当用作抗癌药物时，是可能导致治疗无效的主要因素^1，2。

在过去的几十年里，已经发现了几种植物来源的细胞毒性药物，其中一些被用作抗癌剂¹，^2，3。在这种情况下，紫杉醇被报道为最著名和最活跃的天然来源化疗药物之一^3，4。目前，据估计，市场上超过35%的药物来源于天然产物或受天然产物启发⁵。这些化合物的潜在高毒性在所有研究阶段都需要考虑，因为不同类型的污染物甚至植物本身的代谢成分都会引起毒性作用。因此，应在初步阶段进行药理学和毒理学概况，以评估新的潜在植物疗法的生物活性和安全性。为了评估新的生物活性样品的毒性，无脊椎动物可以被认为是研究的最佳模型。他们要求最低的伦理要求，并允许初步的体外测定，以优先考虑最有前途的产品进行下一轮脊椎动物1^，6测试。

盐水虾俗称盐水虾，是一种小型嗜盐无脊椎动物，属于卤虫属（蒿科，蒿目，甲壳亚门;图1）。在海洋和水生盐碱生态系统中，盐水虾起着重要的营养作用，因为它们以微藻为食，是用于喂养鱼类的浮游动物的组成部分。此外，它们的幼虫（称为无节幼体）在初步研究期间广泛用于评估一般毒性¹，^3，7。

卤虫 属广泛用于致死性研究，也是毒性评估的方便起点，通过根据实验室中生长的无节幼体的能力跟踪潜在生物活性化合物的毒性^1，8。出于这个原因， 盐碱A. salina 的使用在一般毒性研究中获得了吸引力，因为与^{动物模型9}上的其他测试相比，它是一种非常有效且易于使用的方法。

由于其解剖结构简单，体积小，生命周期短，可以在一次实验中研究大量的无脊椎动物。因此，它们将遗传适应性和低成本兼容性与大规模筛查^{相结合1。}在这种情况下，在一般毒性测定中使用盐水虾显示出几个优点，例如快速生长（从孵化到第一次结果需要28-72小时），成本效益和商业鸡蛋的长保质期，可以全年使用^3，10。另一方面，由于无脊椎动物具有原始的器官系统并且缺乏适应性免疫系统，因此它们并不代表人类细胞的完美和可靠的模型¹。

但是，它为所选样品的一般毒性提供了初步评估方法。由于它被广泛用作致死性测定，它可以提供有关潜在抗癌剂毒性作用的临时指示。它还经常用于获得有关具有任何其他生物活性的化合物的一般毒性的反馈，为此必须显示 卤虫 虾中可能的最低死亡率。

在我们小组正在进行的一项研究中，来自 Plectranthus 物种的不同提取物显示出抗氧化和抗菌活性（未发表的结果）。同时，通过纯化提取物获得分离的化合物，然后进行化学修饰。然后对提取物、纯化合物和半合成衍生物进行一般毒性测试。在这种情况下，本工作旨在概述 使用卤虫 致死性生物测定法来评估来自 Plectranthus¹¹属不同植物的生物活性提取物和分离化合物的一般毒性和潜在细胞毒性活性。

图1:显微镜下的 盐卤虫 。 在显微镜下看到的新孵化的 盐碱青节 幼体（放大倍数12倍）。 请点击此处查看此图的大图。

研究方案

1. 设备准备

1. 获取市售孵化设备。选择合适的位置来设置孵化设备（图2A）。将漏斗形容器放在黑色支架（包含在套件中）中，然后将漏斗向合适的方向转动以查看水平标记和水龙头。
2. 要制作手工迁移设备，请切开两个 0.5 L（直径 5.8 厘米）塑料瓶的顶部，以获得 12 厘米的最终高度。在每个瓶子底部距离底部 7 厘米处的一侧创建一个直径为 1.5 厘米的孔，并在两个开口之间插入一根 13 厘米的橡胶管（外径 1.3 厘米，内径 0.9 厘米）。用热胶密封开口（图2B），晾干15分钟;将瓶子放在平坦的表面上并装满水以验证没有泄漏。

2.人工盐溶液的制备

1. 在玻璃烧杯中，制备浓度为35g / L的人造盐溶液（盐水虾盐）。为此，请按照制造商的说明将 28 克盐添加到 800mL 自来水中。用搅拌棒混合，直到所有盐完全溶解。
   注意:根据可用容器的大小调整制备的盐溶液的体积。

3. 样品制备

1. 通过溶解适量的提取物（Plectranthus 提取物，Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus;Pc-P. cylindraceus ; 和 Pe- P. ecklonii）或化合物 1-5（从 Plectranthus 属获得的两种天然化合物 [1 和 2] 和三种半合成衍生物 [3， 4， 5]; 图3）在二甲基亚砜（DMSO）12中，以获得¹⁰ mg/mL的终浓度（如果样品是水溶性的，则无需使用DMSO）。
2. 使用步骤 2.1 中制备的 990 μL 人工盐水溶液在新微量离心管中稀释 10 μL 每个样品（以及用于阴性对照的 DMSO），以获得 0.1 mg/mL 的终浓度。
3. 在通风橱下，在锥形瓶中，在蒸馏水中制备浓度为1mg / mL¹³，^14，15的重铬酸钾（K 2 Cr ₂O₇）溶液。

4. 盐水虾致死性生物测定

注意:该测定是从几位作者的作品中发展而来的，修改了¹，¹⁶，¹⁷，^18，19。

1. 用步骤2.1中制备的培养基填充孵化容器，直至达到水平标记（500 mL）（图2C）。
2. 将一勺（约0.75克）盐水虾囊肿放入盐溶液中，然后关闭容器。将一盏灯（台灯，40 W，230 V，50 Hz，LED灯泡为8 W，4，000 K，830 lm）直接指向设备（图2A）并将其打开。
3. 将空气供应系统（3 W 输出，50 Hz，230 V）连接到放置在设备顶部的连接器上，然后打开泵。
4. 将室温保持在25±3°C。 盐水虾囊肿在人工盐溶液中孵化，在剧烈曝气，连续照明和稳定温度下，24小时至48小时。
   注意:或者，可以使用立式培养箱。
5. 一旦卵孵化，关闭气泵并等待无节幼体（向漏斗底部移动）与空蛋盒（漂浮在顶部）分离。
6. 为了将未孵化的卵与活的无节幼体分离，打开底部的出口水龙头，将漏斗的内容物排放到手工迁移设备容器的一个容器中（如步骤1.2中所述）。确保含有无节幼体和残留未孵化卵的溶液低于管的水平。在第二个容器中，在管高度上方加入步骤2.1中的残余盐溶液。
7. 用铝箔覆盖容器中的无节幼体和残留的未孵化卵。将灯放在第二个容器上，只放盐溶液。盐水虾会被光线吸引并从一个容器迁移到另一个容器（收获容器），导致卵（缓慢沉淀到底部）和活 卤虫之间的有效分离。
8. 然后，将设备置于步骤4.4中使用的相同条件下的培养箱中4小时（图2E）。从收获容器中收集 900 μL 含有 10 至 15 个无节幼体的盐水溶液。将带有无节幼体的盐水溶液置于24孔板的每个孔中（图2F）;所有样品一式四份进行测试。
9. 将阴性对照（DMSO）、阳性对照（K 2 Cr₂O₇，重铬酸钾）、人造盐溶液和每个样品各加入100μL到各自的孔中（图2F）^13，14。
   注意:每个孔中的样品浓度为0.01mg / mL。盐溶液中阳性对照的最终浓度为0.1mg/mL，以确保井中的所有无节幼体都暴露于重铬酸钾的毒性作用并死亡。人造盐溶液将充当空白。
10. 将板在25±3°C下在照明下孵育24小时（图2G）。24小时后，在双目显微镜（12x）²⁰（图2H）下记录每个孔中死亡幼虫（非移动无节幼体5秒）的数量。或者，使用手持镜头。
11. 加入100μL重铬酸钾溶液，诱导剩余活幼虫死亡，等待6小时。在显微镜下计算每个孔中的死亡幼虫总数。根据以下公式确定死亡率。
    
12. 一式三份进行所有测定。计算标准差（SD），并将结果表示为三个独立实验的平均值，每个实验都有内部一式四份（n = 12），±SD。正如Meyer等人所提到的，将LC_50<1，000 μg/mL的粗提取物和纯化合物视为有毒;另外，考虑到盐水虾的死亡率与测试样品的浓度成正比²¹。

图2:卤虫盐碱致死性生物测定法。 （A） 用于孵化盐水虾囊肿的市售设备;（二）手工制作的迁移设备;（三）装满盐水溶液的孵化容器;（D） 收集未孵化的卵和无节幼体;（五）迁移步骤中培养箱中的手工设备。远离灯的容器应用铝箔覆盖;但是，为了更好地查看此处的设置安装，它被删除了;（F） 在进行测定之前在孔中收获卤虫。化合物应如图所示放置:-指阴性对照（DMSO），+至阳性对照（K 2 Cr₂O₇），盐至人工盐溶液，1至3至样品进行测试（在这种情况下化合物1-3）;（G） 孵育含有卤虫的24孔板和选定的样品;（H）双目显微镜下的卤血计数。请点击此处查看此图的大图。

图3:所选化合物的结构。 化合物1-2的结构，从 Plectranthus 物种中提取，和化合物3-5，通过半合成获得。 请点击此处查看此图的大图。

结果

我们小组最近研究的一些天然产物的一般毒性是通过盐水虾致死性生物测定法进行评估的。四种提取物（Pa- P.Pb- P. barbatus;Pc- P. cylindraceus;和Pe- P. ecklonii）来自Plectranthus属，以其抗氧化活性（未发表的结果）而闻名，进行了测试。此外，从Plectranthus属获得的两种天然化合物（1和2）和三种半合成衍生物（3，4，5;图3），在另一部作品

讨论

在过去的几年中，科学界对毒性筛查的替代模型的关注有所增加²¹。除了盐藻致死性生物测定外，通常还执行其他方法来评估样品耐受性，包括脊椎动物生物测定（例如啮齿动物），无脊椎动物（例如斑马鱼），使用酵母菌株或细胞的体外方法以及计算机方法²²，²³，^24，25

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Thermo Fisher Scientific, Denmark	174899	Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish
Aluminium foil	Albal	-	Can be purchased in supermarket
Artemio Set	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	61066000	Can be purchased in pet shops
Binocular microscope	Ceti, Belgium	1700.0000	Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz
Bottles	-	-	0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm
Brine shrimp cysts	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	3090700	Can be purchased in pet shops
Brine shrimp salt	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	3090600	Can be purchased in pet shops
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	VWR chemicals	CAS: 67-68-5	99% purity
Discartable tips	Diamond	F171500	Volume range: 100 - 1000 µL
Eppendorf microtubes	BRAND	7,80,546	Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY
Erlenmeyer flask	VWR chemicals	4,47,109	volume: 100 mL
Glass beaker	Normax	3.2111654N	Volume: 1000 mL
Gloves	Guantes Luna	GLSP3	-
GraphPad Prism	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	-	GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software
Home-made A. salina Grower	-	-	Home made: two plastic bottles connected by a hose
Hot glue	Parkside	PHP500E3	230 V, 50 Hz, 25 W
Incubator	Heidolph Instruments, Denmark	-	One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006
Light	Roblan	SKYC3008FE14	LED light bulb
Micropipettes	VWR chemicals	613-5265	Volume range: 100 - 1000 µL
Potassium dichromate (K2Cr2O7)	VWR chemicals	CAS: 7778-50-9	99% purity
Pump ProAir a50	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	-	Included in the Artemio Set+1 kit
Rubber tube	-	-	1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter
Stirring rod	VWR chemicals	441-0147	6 mm, 250 mm
Termometer	VWR chemicals	620-0821	0 - 100 °C