Bioensaio de Letalidade Utilizando Artemia salina L.

Resumo

Este trabalho tem como objetivo avaliar e revisar o procedimento de bioensaio de letalidade de Artemia salina , também identificado como ensaio de letalidade de camarão em salmoura. Este método simples e barato fornece informações sobre a toxicidade geral (considerada como uma avaliação preliminar de toxicidade) das amostras, ou seja, produtos naturais.

Resumo

Os produtos naturais têm sido usados desde os tempos antigos para produzir medicamentos. Hoje em dia, existem muitas drogas quimioterápicas obtidas de fontes naturais e usadas contra uma infinidade de doenças. Infelizmente, a maioria desses compostos geralmente exibe toxicidade sistêmica e efeitos adversos. A fim de melhor avaliar a tolerabilidade de amostras potencialmente bioativas selecionadas, o camarão de salmoura (Artemia salina) é geralmente utilizado como modelo em estudos de letalidade. O teste de A. salina baseia-se na capacidade dos compostos bioativos estudados de matar os microcrustáceos em seu estágio larval (náuplios). Este método representa um ponto de partida conveniente para estudos de citotoxicidade, bem como para a triagem de toxicidade geral de produtos sintéticos, semissintéticos e naturais. Pode ser considerado um ensaio simples, rápido e de baixo custo, em comparação com muitos outros ensaios (células in vitro ou cepas de levedura , peixe-zebra, roedores) geralmente adequados para os fins acima mencionados; além disso, pode ser facilmente realizado mesmo sem qualquer treinamento específico. No geral, o ensaio de A. salina representa uma ferramenta útil para a avaliação preliminar da toxicidade de compostos selecionados e o fracionamento bioguiado de extratos de produtos naturais.

Introdução

Os produtos naturais de plantas, animais ou microrganismos têm sido uma área de interesse crescente ao longo dos anos no desenvolvimento de novas moléculas bioativas devido à sua variada gama de atividades biológicas e farmacológicas¹. No entanto, os efeitos colaterais associados, a resistência aos medicamentos ou a especificidade inadequada dos agentes, especialmente quando utilizados como drogas anticancerígenas, representam os principais fatores que podem levar a um tratamento ineficaz ^1,2.

Nas últimas décadas, vários agentes citotóxicos derivados de plantas têm sido descobertos, alguns deles utilizados como agentes anticancerígenos ^1,2,3. Nesse contexto, o paclitaxel é relatado como um dos quimioterápicos de origem natural mais conhecidos e ativos ^3,4. Atualmente, estima-se que mais de 35% de todos os medicamentos no mercado são derivados ou são inspirados em produtos naturais⁵. A potencial alta toxicidade desses compostos requer consideração durante todas as fases do estudo, uma vez que diferentes tipos de contaminantes ou mesmo componentes metabólicos da própria planta podem causar efeitos tóxicos. Por esta razão, os perfis farmacológicos e toxicológicos devem ser realizados na fase preliminar, a fim de avaliar a atividade biológica e a segurança de novos potenciais tratamentos à base de plantas. Para avaliar a toxicidade de novas amostras bioativas, os animais invertebrados podem ser considerados como os melhores modelos a serem estudados. Exigem requisitos éticos mínimos e permitem ensaios preliminares in vitro, para priorizar os produtos mais promissores para a próxima rodada de testes em vertebrados ^1,6.

A. salina é um pequeno invertebrado halofílico pertencente ao gênero Artemia (família Artemiidae, ordem Anostraca, subfilo Crustacea; Figura 1). Nos ecossistemas salinos marinhos e aquáticos, os camarões de salmoura desempenham um importante papel nutricional, pois se alimentam de microalgas e são constituintes do zooplâncton usado para alimentar peixes. Além disso, suas larvas (conhecidas como náuplios) são amplamente utilizadas na avaliação da toxicidade geral durante estudos preliminares ^1,3,7.

Artemia spp. são amplamente utilizados em estudos de letalidade e também são um ponto de partida conveniente para avaliações de toxicidade, rastreando a toxicidade de compostos potencialmente bioativos com base em sua capacidade de matar náuplios cultivados em laboratório ^1,8. Por esse motivo, o uso de A. salina ganhou atração em estudos gerais de toxicidade, por ser um método muito eficiente e de fácil utilização, em comparação com outros ensaios em modelos animais⁹.

Devido à sua anatomia simples, tamanho minúsculo e ciclo de vida curto, um grande número de invertebrados pode ser estudado em um único experimento. Como tal, combinam amenidade genética e compatibilidade de baixo custo com rastreios em larga escala¹. Nesse contexto, o uso do camarão de salmoura em um ensaio geral de toxicidade apresenta diversas vantagens, como crescimento rápido (28-72 h é necessário desde a eclosão até os primeiros resultados), custo-efetividade e longa vida útil dos ovos comerciais, que podem ser utilizados durante todo o ano ^3,10. Por outro lado, uma vez que os invertebrados possuem um sistema orgânico primitivo e carecem de um sistema imunológico adaptativo, eles não representam um modelo perfeito e confiável para as células humanas¹.

No entanto, fornece um método de avaliação preliminar para a toxicidade geral de amostras selecionadas. Uma vez que é amplamente utilizado como um ensaio de letalidade, pode fornecer indicações provisórias sobre os efeitos tóxicos de potenciais agentes anticancerígenos. Muitas vezes também é usado para obter feedback sobre a toxicidade geral de compostos dotados de quaisquer outras atividades biológicas para as quais é essencial mostrar a menor taxa de mortalidade possível entre os camarões Artemia .

Em um estudo em andamento de nosso grupo, diferentes extratos de espécies de Plectranthus mostraram atividades antioxidantes e antimicrobianas (resultados não publicados). Paralelamente, compostos isolados foram obtidos por purificação dos extratos e então modificados quimicamente. Os extratos, compostos puros e derivados semissintéticos foram então testados em termos de toxicidade geral. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo dar uma visão geral do uso do bioensaio de letalidade Artemia para a avaliação da toxicidade geral e potencial atividade citotóxica de extratos bioativos e compostos isolados de diferentes plantas do gênero Plectranthus¹¹.

Figura 1: Artemia salina ao microscópio. Náuplios recém-eclodidos de A. salina como visto ao microscópio (ampliação 12x). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Preparação do equipamento

1. Adquirir equipamentos de incubação comercialmente disponíveis. Selecione um local adequado para configurar o equipamento de eclosão (Figura 2A). Coloque o recipiente em forma de funil no suporte preto (incluído no conjunto) e gire o funil em uma direção adequada para ver a marca de nível e a torneira.
2. Para fazer equipamentos de migração feitos à mão, corte a parte superior de duas garrafas plásticas de 0,5 L (5,8 cm de diâmetro) para obter uma altura final de 12 cm. Crie um orifício de 1,5 cm de diâmetro de um lado a 7 cm do fundo em cada garrafa e insira um tubo de borracha de 13 cm (1,3 cm de diâmetro externo e 0,9 cm de diâmetro interno) entre as duas aberturas. Selar as aberturas com cola quente (Figura 2B) e deixar secar por 15 min; Coloque as garrafas em uma superfície plana e encha-as com água para verificar se não há vazamento.

2. Preparação de solução salina artificial

1. Num copo de vidro, preparar uma solução salina artificial (sal de camarão em salmoura) a uma concentração de 35 g/L. Para fazer isso, adicione 28 g de sal a 800mL de água da torneira, de acordo com as instruções do fabricante. Misture com uma haste de agitação até que todo o sal esteja completamente dissolvido.
   NOTA: Ajustar o volume da solução salina preparada de acordo com o tamanho dos recipientes disponíveis.

3. Preparação da amostra

1. Preparar todas as amostras em um tubo de microcentrífuga, dissolvendo uma quantidade adequada de extratos (extratos de Plectranthus , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; e Pe- P. ecklonii) ou compostos 1-5 (dois compostos naturais [1 e 2] obtidos de Plectranthus spp. e três derivados semissintéticos [3, 4, 5]; Figura 3) em dimetilsulfóxido (DMSO)12, de modo a obter uma concentração final de ¹⁰ mg/mL (se a amostra for solúvel em água, não é necessário o uso de DMSO).
2. Diluir 10 μL de cada amostra (e DMSO para o controlo negativo) num novo tubo de microcentrífuga utilizando 990 μL de solução salina artificial preparada no passo 2.1, para obter uma concentração final de 0,1 mg/ml.
3. Sob um exaustor, num balão de Erlenmeyer, preparar uma solução de dicromato de potássio (K2 Cr₂O₇) em água destilada na concentração de 1 mg/ml^13,14,15.

4. Bioensaio de letalidade de camarão em salmoura

NOTA: Este ensaio é desenvolvido a partir de trabalhos de diversos autores com modificações 1,16,17,18,19.

1. Encher o recipiente de eclosão com o meio preparado na etapa 2.1 até a marca de nível (500 mL) (Figura 2C).
2. Coloque uma colher (aproximadamente 0,75 g) de cistos de camarão de salmoura na solução salina e, em seguida, feche o recipiente. Coloque uma lâmpada (luminária de mesa, 40 W, 230 V, 50 Hz, com uma lâmpada LED de 8 W, 4.000 K, 830 lm) apontando diretamente para o equipamento (Figura 2A) e ligue-a.
3. Conecte o sistema do fornecedor de ar (saída de 3 W, 50 Hz, 230 V) ao conector colocado na parte superior do equipamento e ligue a bomba.
4. Manter a temperatura ambiente a 25 ± 3 °C. Os cistos de camarão de salmoura eclodem na solução salina artificial, sob aeração vigorosa, iluminação contínua e temperatura estável, após 24 h a 48 h.
   NOTA: Alternativamente, uma incubadora vertical pode ser usada.
5. Uma vez que os ovos tenham eclodido, desligue a bomba de ar e espere até que os náuplios (movendo-se em direção ao fundo do funil) sejam separados das caixas de ovos vazias (flutuando no topo).
6. Para separar os ovos não eclodidos dos náuplios vivos, abra a torneira de saída no fundo e descarregue o conteúdo do funil num dos recipientes do recipiente do equipamento de migração feito à mão (descrito na etapa 1.2). Certifique-se de que a solução que contém os náuplios e os ovos residuais não eclodidos está abaixo do nível do tubo. No segundo recipiente, adicionar a solução salina residual da etapa 2.1 acima da altura do tubo.
7. Cubra o recipiente com os náuplios e os ovos residuais não eclodidos usando papel alumínio. Coloque a lâmpada no segundo recipiente apenas com a solução salina. O camarão de salmoura será atraído pela luz e migrará de um recipiente para o outro (recipiente de colheita), levando a uma separação eficiente entre ovos (sedimentados lentamente até o fundo) e Artemia viva.
8. Em seguida, coloque o equipamento na incubadora nas mesmas condições utilizadas na etapa 4.4 por 4 h (Figura 2E). Do recipiente de colheita, coletar 900 μL de solução salina contendo 10 a 15 náuplios. Colocar a solução salina com náuplios em cada poço de uma placa de 24 poços (Figura 2F); todas as amostras são testadas em quadruplicados.
9. Adicionar 100 μL cada um do controle negativo (DMSO), o controle positivo (K 2Cr₂O₇, dicromato de potássio), a solução salina artificial e cada uma das amostras ao respectivo poço (Figura 2F)^13,14.
   NOTA: As amostras em cada poço estarão na concentração de 0,01 mg/mL. A concentração final do controle positivo em solução salina será de 0,1 mg/mL, para garantir que todos os náuplios do poço sejam expostos ao efeito tóxico do dicromato de potássio e morram. A solução salina artificial atuará como em branco.
10. Incubar a placa a 25 ± 3 °C sob iluminação durante 24 h (figura 2G). Após 24 h, registrar o número de larvas mortas (náuplios não móveis por 5 s) em cada poço sob microscópio binocular (12x)²⁰ (Figura 2H). Alternativamente, use uma lente de mão.
11. Adicionar 100 μL de solução de dicromato de potássio, para induzir a morte das larvas vivas restantes, e aguardar 6 h. Conte o total de larvas mortas em cada poço sob um microscópio. Determine a taxa de mortalidade de acordo com a equação a seguir.
    
12. Realize todo o ensaio em triplicado. Calcular desvios-padrão (DP) e expressar os resultados como a média de três experimentos independentes, cada um com quadruplicados internos (n = 12), ± DP. Como mencionado por Meyer et al., consideram extratos brutos e compostos puros com CL₅₀< 1.000 μg/mL como tóxicos; além disso, levar em conta que a taxa de mortalidade do camarão de salmoura é proporcional à concentração das amostras testadas²¹.

Figura 2: Método de bioensaio de letalidade de Artemia salina. (A) Equipamento comercialmente disponível empregado para a eclosão de cistos de camarão de salmoura; (B) Equipamento de migração artesanal; (C) Recipiente para incubação cheio de solução salina; (D) Coleta de ovos não eclodidos e náuplios; (E) Equipamento artesanal na incubadora durante a etapa de migração. O recipiente longe da lâmpada deve ser coberto com papel alumínio; no entanto, para uma melhor visualização da instalação do conjunto aqui foi removido; (F) Colheita de artêmia em poços antes da realização do ensaio. Os compostos devem ser colocados como mostrado: - refere-se ao controle negativo (DMSO), + ao controle positivo (K2 Cr₂O₇), sal à solução salina artificial e 1 a 3 às amostras a serem testadas (neste caso, compostos 1-3); (G) Incubação da placa de 24 poços contendo Artemia e das amostras selecionadas; (H) Contagem de artemia ao microscópio binocular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Estruturas de compostos selecionados. Estrutura dos compostos 1-2, extraídos de espécies de Plectranthus , e compostos 3-5, obtidos por semi-síntese. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

A toxicidade geral de alguns produtos naturais recentemente estudados pelo nosso grupo foi avaliada através do bioensaio de letalidade de camarão em salmoura. Quatro extratos (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; e Pe- P. ecklonii) do gênero Plectranthus , conhecido por sua atividade antioxidante (resultados não publicados), foram testados. Além disso, dois compostos naturais (1 e 2) obtidos de Plectranthus spp., e três derivados semissintéti...

Discussão

Nos últimos anos, a comunidade científica tem aumentado sua atenção para modelos alternativos para exames de toxicidade²¹. Além do bioensaio de letalidade de A. salina, outras metodologias são geralmente realizadas para a avaliação da tolerabilidade da amostra e incluem bioensaios de vertebrados (como roedores), invertebrados (como o peixe-zebra), métodos in vitro usando cepas ou células de levedura e métodos in silico ^{22,23,24,25<...}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Thermo Fisher Scientific, Denmark	174899	Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish
Aluminium foil	Albal	-	Can be purchased in supermarket
Artemio Set	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	61066000	Can be purchased in pet shops
Binocular microscope	Ceti, Belgium	1700.0000	Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz
Bottles	-	-	0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm
Brine shrimp cysts	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	3090700	Can be purchased in pet shops
Brine shrimp salt	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	3090600	Can be purchased in pet shops
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	VWR chemicals	CAS: 67-68-5	99% purity
Discartable tips	Diamond	F171500	Volume range: 100 - 1000 µL
Eppendorf microtubes	BRAND	7,80,546	Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY
Erlenmeyer flask	VWR chemicals	4,47,109	volume: 100 mL
Glass beaker	Normax	3.2111654N	Volume: 1000 mL
Gloves	Guantes Luna	GLSP3	-
GraphPad Prism	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	-	GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software
Home-made A. salina Grower	-	-	Home made: two plastic bottles connected by a hose
Hot glue	Parkside	PHP500E3	230 V, 50 Hz, 25 W
Incubator	Heidolph Instruments, Denmark	-	One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006
Light	Roblan	SKYC3008FE14	LED light bulb
Micropipettes	VWR chemicals	613-5265	Volume range: 100 - 1000 µL
Potassium dichromate (K2Cr2O7)	VWR chemicals	CAS: 7778-50-9	99% purity
Pump ProAir a50	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	-	Included in the Artemio Set+1 kit
Rubber tube	-	-	1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter
Stirring rod	VWR chemicals	441-0147	6 mm, 250 mm
Termometer	VWR chemicals	620-0821	0 - 100 °C