Saggio biologico di letalità con Artemia salina L.

Riepilogo

Questo lavoro mira a valutare e rivedere la procedura di saggio biologico di letalità dell'Artemia salina , identificata anche come saggio di letalità dei gamberetti di salamoia. Questo metodo semplice ed economico fornisce informazioni sulla tossicità generale (considerata come una valutazione preliminare della tossicità) dei campioni, vale a dire i prodotti naturali.

Abstract

I prodotti naturali sono stati utilizzati fin dall'antichità per produrre medicinali. Al giorno d'oggi, ci sono molti farmaci chemioterapici ottenuti da fonti naturali e utilizzati contro una pletora di malattie. Sfortunatamente, la maggior parte di questi composti spesso mostrano tossicità sistemica ed effetti avversi. Al fine di valutare meglio la tollerabilità di campioni selezionati potenzialmente bioattivi, il gambero salamoia (Artemia salina) viene generalmente utilizzato come modello negli studi di letalità. Il test di A. salina si basa sulla capacità dei composti bioattivi studiati di uccidere i microcrostacei nel loro stadio larvale (naupli). Questo metodo rappresenta un comodo punto di partenza per gli studi di citotossicità, nonché per lo screening della tossicità generale di prodotti sintetici, semisintetici e naturali. Può essere considerato un test semplice, rapido e a basso costo, rispetto a molti altri saggi (cellule in vitro o ceppi di lievito, zebrafish, roditori) generalmente adatti agli scopi sopra indicati; Inoltre, può essere facilmente eseguito anche senza alcuna formazione specifica. Nel complesso, il saggio di A. salina rappresenta uno strumento utile per la valutazione preliminare della tossicità di composti selezionati e il frazionamento bioguidato di estratti di prodotti naturali.

Introduzione

I prodotti naturali di piante, animali o microrganismi sono stati una crescente area di interesse nel corso degli anni nello sviluppo di nuove molecole bioattive a causa della loro variegata gamma di attività biologiche e farmacologiche¹. Tuttavia, gli effetti collaterali associati, la resistenza ai farmaci o l'inadeguata specificità degli agenti, specialmente se usati come farmaci antitumorali, rappresentano i principali fattori che possono portare a un trattamento inefficace ^1,2.

Negli ultimi decenni sono stati scoperti diversi agenti citotossici di origine vegetale, alcuni dei quali utilizzati come agenti antitumorali ^1,2,3. In questo contesto, il paclitaxel è segnalato come uno dei farmaci chemioterapici più noti e attivi di origine naturale ^3,4. Attualmente, si stima che oltre il 35% di tutti i farmaci sul mercato derivino o siano ispirati a prodotti naturali⁵. La potenziale elevata tossicità di questi composti richiede considerazione durante tutte le fasi di studio, poiché diversi tipi di contaminanti o anche componenti metabolici della pianta stessa possono causare effetti tossici. Per questo motivo, i profili farmacologici e tossicologici dovrebbero essere intrapresi nella fase preliminare, per valutare l'attività biologica e la sicurezza di nuovi potenziali trattamenti a base vegetale. Per valutare la tossicità di nuovi campioni bioattivi, gli animali invertebrati possono essere considerati i migliori modelli da studiare. Richiedono requisiti etici minimi e consentono test preliminari in vitro, per dare priorità ai prodotti più promettenti per il prossimo ciclo di test sui vertebrati ^1,6.

Comunemente noto come gambero salamoia, A. salina è un piccolo invertebrato alofilo appartenente al genere Artemia (famiglia Artemiidae, ordine Anostraca, subphylum Crustacea; Figura 1). Negli ecosistemi salini marini e acquatici, i gamberetti di salamoia svolgono un importante ruolo nutrizionale in quanto si nutrono di microalghe e sono costituenti dello zooplancton utilizzato per nutrire i pesci. Inoltre, le loro larve (note come naupli) sono ampiamente utilizzate nella valutazione della tossicità generale durante gli studi preliminari ^1,3,7.

Le Artemia spp. sono ampiamente utilizzate negli studi di letalità e sono anche un comodo punto di partenza per le valutazioni di tossicità, monitorando la tossicità di composti potenzialmente bioattivi in base alla loro capacità di uccidere i naupli coltivati in laboratorio ^1,8. Per questo motivo, l'uso di A. salina ha guadagnato attrazione negli studi di tossicità generale, perché è un metodo molto efficiente e facile da usare, rispetto ad altri test su modelli animali⁹.

Grazie alla loro anatomia semplice, alle piccole dimensioni e al breve ciclo di vita, un vasto numero di invertebrati può essere studiato in un singolo esperimento. In quanto tali, combinano l'amenabilità genetica e la compatibilità a basso costo con screening su larga scala¹. In questo contesto, l'uso di gamberetti di salamoia in un saggio di tossicità generale mostra diversi vantaggi, come la crescita rapida (28-72 ore sono necessarie dalla schiusa ai primi risultati), l'economicità e la lunga durata di conservazione delle uova commerciali, che possono essere utilizzate tutto l'anno ^3,10. D'altra parte, poiché gli invertebrati hanno un sistema di organi primitivo e mancano di un sistema immunitario adattativo, non rappresentano un modello perfetto e affidabile per le cellule umane¹.

Tuttavia, fornisce un metodo di valutazione preliminare per la tossicità generale di campioni selezionati. Poiché è ampiamente usato come test di letalità, può fornire indicazioni provvisorie sugli effetti tossici di potenziali agenti antitumorali. Viene spesso utilizzato anche per ottenere feedback sulla tossicità generale di composti dotati di qualsiasi altra attività biologica per la quale è essenziale mostrare il più basso tasso di mortalità possibile tra i gamberetti di Artemia .

In uno studio in corso dal nostro gruppo, diversi estratti di specie Plectranthus hanno mostrato attività antiossidanti e antimicrobiche (risultati non pubblicati). Parallelamente, composti isolati sono stati ottenuti mediante purificazione degli estratti e sono stati poi modificati chimicamente. Gli estratti, i composti puri e i derivati semisintetici sono stati quindi testati in termini di tossicità generale. In questo contesto, il presente lavoro si propone di fornire una panoramica dell'uso del saggio biologico di letalità dell'Artemia per la valutazione della tossicità generale e della potenziale attività citotossica di estratti bioattivi e composti isolati da diverse piante del genere Plectranthus¹¹.

Figura 1: Artemia salina al microscopio. Naupli appena schiusi di A. salina visti al microscopio (ingrandimento 12x). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocollo

1. Preparazione dell'attrezzatura

1. Acquisire attrezzature di schiusa disponibili in commercio. Selezionare un luogo adatto per installare l'attrezzatura di schiusa (Figura 2A). Posizionare il contenitore a forma di imbuto nel supporto nero (incluso nel set) e ruotare l'imbuto in una direzione adatta per vedere il segno di livello e il rubinetto.
2. Per realizzare attrezzature di migrazione fatte a mano, tagliare la parte superiore di due bottiglie di plastica da 0,5 L (5,8 cm di diametro) per ottenere un'altezza finale di 12 cm. Creare un foro di 1,5 cm di diametro su un lato a 7 cm dal fondo in ogni bottiglia e inserire un tubo di gomma di 13 cm (1,3 cm di diametro esterno e 0,9 cm interno) tra le due aperture. Sigillare le aperture con colla a caldo (Figura 2B) e lasciare asciugare per 15 minuti; Metti le bottiglie su una superficie piana e riempile d'acqua per verificare che non ci siano perdite.

2. Preparazione della soluzione salina artificiale

1. In un becher di vetro, preparare una soluzione salina artificiale (sale di gamberetti di salamoia) ad una concentrazione di 35 g/L. Per fare questo, aggiungere 28 g di sale a 800 ml di acqua del rubinetto, secondo le istruzioni del produttore. Mescolare con una bacchetta di agitazione fino a quando tutto il sale è completamente sciolto.
   NOTA: Regolare il volume della soluzione salina preparata in base alle dimensioni dei contenitori disponibili.

3. Preparazione del campione

1. Preparare tutti i campioni in una provetta da microcentrifuga sciogliendo una quantità adeguata di estratti (estratti di Plectranthus , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; e Pe- P. ecklonii) o composti 1-5 (due composti naturali [1 e 2] ottenuti da Plectranthus spp. e tre derivati semisintetici [3, 4, 5]; Figura 3) nel dimetilsolfossido (DMSO)12, in modo da ottenere una concentrazione finale di ¹⁰ mg/ml (se il campione è solubile in acqua, non è necessario l'uso di DMSO).
2. Diluire 10 μL di ciascun campione (e DMSO per il controllo negativo) in una nuova provetta da microcentrifuga utilizzando 990 μL di soluzione salina artificiale preparata nella fase 2.1, per ottenere una concentrazione finale di 0,1 mg/ml.
3. Sotto una cappa aspirante, in un matraccio di Erlenmeyer, preparare una soluzione di dicromato di potassio(K 2 Cr₂O₇) in acqua distillata ad una concentrazione di 1 mg/mL^13,14,15.

4. Saggio biologico sulla letalità dei gamberetti di salamoia

NOTA: Questo saggio è sviluppato dalle opere di diversi autori con modifiche 1,16,17,18,19.

1. Riempire il recipiente da cova con il mezzo preparato al punto 2.1 fino al livello (500 ml) (figura 2C).
2. Mettere un cucchiaio (circa 0,75 g) di cisti di gamberetti di salamoia nella soluzione salina, quindi chiudere il contenitore. Posizionare una lampada (lampada da tavolo, 40 W, 230 V, 50 Hz, con una lampadina a LED da 8 W, 4.000 K, 830 lm) rivolta direttamente verso l'apparecchiatura (Figura 2A) e accenderla.
3. Collegare il sistema di alimentazione dell'aria (uscita 3 W, 50 Hz, 230 V) al connettore posto sulla parte superiore dell'apparecchiatura e accendere la pompa.
4. Mantenere la temperatura ambiente a 25 ± 3 °C. Le cisti di salamoia si schiudono nella soluzione salina artificiale, sotto aerazione vigorosa, illuminazione continua e temperatura stabile, dopo 24 ore a 48 ore.
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un incubatore verticale.
5. Una volta che le uova si sono schiuse, spegnere la pompa dell'aria e attendere che i naupli (spostandosi verso il fondo dell'imbuto) siano separati dalle casse delle uova vuote (galleggianti nella parte superiore).
6. Per separare le uova non schiuse dai naupli vivi, aprire il rubinetto di uscita in basso e scaricare il contenuto dell'imbuto in uno dei contenitori del contenitore dell'attrezzatura di migrazione fatto a mano (descritto al punto 1.2). Assicurarsi che la soluzione contenente i naupli e le uova residue non schiuse sia al di sotto del livello del tubo. Nel secondo contenitore, aggiungere la soluzione salina residua dal punto 2.1 sopra l'altezza del tubo.
7. Coprire il contenitore con i naupli e le uova residue non schiuse usando un foglio di alluminio. Posizionare la lampada sul secondo contenitore con solo la soluzione salina. I gamberetti di salamoia saranno attratti dalla luce e migreranno da un contenitore all'altro (contenitore di raccolta), portando a un'efficiente separazione tra uova (lentamente sedimentate sul fondo) e Artemia viva.
8. Quindi, posizionare l'apparecchiatura nell'incubatore nelle stesse condizioni utilizzate al punto 4.4 per 4 ore (Figura 2E). Dal contenitore di raccolta, raccogliere 900 μL di soluzione salina contenente da 10 a 15 naupli. Porre la soluzione salina con naupli in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (Figura 2F); Tutti i campioni sono testati in quadruplicati.
9. Aggiungere 100 μL ciascuno del controllo negativo (DMSO), del controllo positivo (K 2 Cr₂O₇,dicromato di potassio), della soluzione salina artificiale e di ciascuno dei campioni al rispettivo pozzetto (Figura 2F)^13,14.
   NOTA: I campioni in ciascun pozzetto saranno ad una concentrazione di 0,01 mg/ml. La concentrazione finale del controllo positivo in soluzione salina sarà di 0,1 mg/ml, per essere sicuri che tutti i naupli nel pozzetto siano esposti all'effetto tossico del dicromato di potassio e muoiano. La soluzione salina artificiale agirà come bianco.
10. Incubare la piastra a 25 ± 3 °C sotto illuminazione per 24 ore (Figura 2G). Dopo 24 ore, registrare il numero di larve morte (naupli non mobili per 5 s) in ciascun pozzetto al microscopio binoculare (12x)²⁰ (Figura 2H). In alternativa, utilizzare una lente a mano.
11. Aggiungere 100 μL di soluzione di bicromato di potassio, per indurre la morte delle restanti larve viventi, e attendere 6 ore. Conta le larve morte totali in ciascun pozzetto al microscopio. Determinare il tasso di mortalità secondo la seguente equazione.
    
12. Eseguire tutto il test in triplice copia. Calcolare le deviazioni standard (SD) ed esprimere i risultati come media di tre esperimenti indipendenti, ciascuno con quadruplicati interni (n = 12), ± SD. Come menzionato da Meyer et al., considerare gli estratti grezzi e i composti puri con LC₅₀< 1.000 μg / mL come tossici; Inoltre, tenere conto del fatto che il tasso di mortalità dei gamberetti di salamoia è proporzionale alla concentrazione dei campioni testati²¹.

Figura 2: Metodo di saggio biologico di letalità di Artemia salina. A) attrezzature disponibili in commercio impiegate per la schiusa di cisti di gamberetti di salamoia; b) attrezzature per la migrazione fatte a mano; c) recipiente da cova riempito di soluzione salina; D) raccolta di uova e naupli non schiusi; (E) Attrezzature fabbricate a mano nell'incubatore durante la fase di migrazione. Il contenitore lontano dalla lampada deve essere coperto con un foglio di alluminio; Tuttavia, per una migliore visione dell'installazione del set qui è stato rimosso; (F) Raccolta di Artemia in pozzi prima di eseguire il test. I composti devono essere posizionati come indicato: - si riferisce al controllo negativo (DMSO), + al controllo positivo (K 2Cr₂O₇), sale alla soluzione salina artificiale e da 1 a 3 ai campioni da testare (in questo caso composti 1-3); (G) Incubazione della piastra a 24 pozzetti contenente Artemia e dei campioni selezionati; (H) Conta dell'artemia al microscopio binoculare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Strutture di composti selezionati. Struttura dei composti 1-2, estratti dalle specie di Plectranthus , e composti 3-5, ottenuti per semisintesi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Risultati

La tossicità generale di alcuni prodotti naturali recentemente studiati dal nostro gruppo è stata valutata attraverso il saggio biologico sulla letalità dei gamberetti in salamoia. Quattro estratti (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; e Pe- P. ecklonii) del genere Plectranthus , noti per la loro attività antiossidante (risultati non pubblicati), sono stati testati. Inoltre, due composti naturali (1 e 2) ottenuti da Plectranthus spp., e tre deri...

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Discussione

Negli ultimi anni, la comunità scientifica ha aumentato la sua attenzione verso modelli alternativi per gli screening di tossicitಹ. Oltre al saggio biologico sulla letalità di A. salina, vengono solitamente eseguite altre metodologie per la valutazione della tollerabilità del campione e includono saggi biologici di vertebrati (come roditori), invertebrati (come il pesce zebra), metodi in vitro che utilizzano ceppi o cellule di lievito e metodi in silico

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Thermo Fisher Scientific, Denmark	174899	Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish
Aluminium foil	Albal	-	Can be purchased in supermarket
Artemio Set	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	61066000	Can be purchased in pet shops
Binocular microscope	Ceti, Belgium	1700.0000	Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz
Bottles	-	-	0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm
Brine shrimp cysts	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	3090700	Can be purchased in pet shops
Brine shrimp salt	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	3090600	Can be purchased in pet shops
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	VWR chemicals	CAS: 67-68-5	99% purity
Discartable tips	Diamond	F171500	Volume range: 100 - 1000 µL
Eppendorf microtubes	BRAND	7,80,546	Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY
Erlenmeyer flask	VWR chemicals	4,47,109	volume: 100 mL
Glass beaker	Normax	3.2111654N	Volume: 1000 mL
Gloves	Guantes Luna	GLSP3	-
GraphPad Prism	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	-	GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software
Home-made A. salina Grower	-	-	Home made: two plastic bottles connected by a hose
Hot glue	Parkside	PHP500E3	230 V, 50 Hz, 25 W
Incubator	Heidolph Instruments, Denmark	-	One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006
Light	Roblan	SKYC3008FE14	LED light bulb
Micropipettes	VWR chemicals	613-5265	Volume range: 100 - 1000 µL
Potassium dichromate (K2Cr2O7)	VWR chemicals	CAS: 7778-50-9	99% purity
Pump ProAir a50	JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany	-	Included in the Artemio Set+1 kit
Rubber tube	-	-	1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter
Stirring rod	VWR chemicals	441-0147	6 mm, 250 mm
Termometer	VWR chemicals	620-0821	0 - 100 °C