小鼠子宫骶韧带和盆底器官的分离和表征

摘要

本文提出了解剖子宫骶韧带和其他盆底组织（包括小鼠的子宫颈、直肠和膀胱）的详细方案，以扩大对女性生殖组织的研究。

摘要

盆腔器官脱垂 （POP） 是一种影响盆底完整性、结构和机械支撑的疾病。骨盆底的器官由不同的解剖结构支撑，包括肌肉、韧带和骨盆筋膜。子宫骶韧带 （USL） 是一种关键的承重结构，USL 损伤导致发生 POP 的风险更高。本协议描述了小鼠USL和盆底器官的解剖，以及使用拉曼光谱获取有关USL生化组成和功能的独特数据以及机械行为的评估。小鼠是临床前研究的宝贵模型，但解剖小鼠USL是一个困难而复杂的过程。该程序提供了一种指导解剖鼠盆底组织（包括USL）的方法，以实现多种评估和表征。这项工作旨在帮助基础科学家和工程师解剖盆底组织，从而扩大USL和盆底条件研究以及使用小鼠模型进行女性健康的临床前研究的可及性。

引言

大约 50% 的女性受盆腔器官脱垂 （^{POP） 的影响}1^，2。这些女性中约有11%符合接受手术修复的标准，成功率很低（~30%）^3，4。POP的特征是由于USL和盆底肌肉无法提供足够的支撑，任何或所有盆腔器官（即膀胱，子宫，子宫颈和直肠）从其自然位置下降⁵。除了诱发因素³，⁶外，这种情况还涉及解剖功能障碍和结缔组织的破坏^，以及神经肌肉损伤。POP 与多种因素相关，例如年龄、体重、胎次和分娩类型（即阴道分娩或剖腹产）。这些因素被认为会影响所有盆底组织的机械完整性，怀孕和胎次被认为是POP⁵，^7，8的主要驱动因素。

子宫骶韧带 （USL） 是子宫、子宫颈和阴道的重要支撑结构，并将子宫颈与骶骨相连⁴.对USL的损害使妇女患POP的风险增加。据信，怀孕和分娩会给USL带来额外的压力，这可能会诱发损伤并增加POP的机会。USL 是由沿韧带异质分布的平滑肌细胞、血管和淋巴管组成的复杂组织，可分为三个不同的部分:颈部、中间和骶区⁹。USL 的机械完整性来源于细胞外基质 （ECM） 成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖⁵、^9、10。已知 I 型胶原纤维是韧带组织的主要承重拉伸成分，因此可能与 USL 衰竭和 POP¹¹ 有关。

目前还缺乏关于持久性有机污染物在妇女中的病因、患病率和影响的知识。开发适当的POP动物模型对于促进我们对女性盆底的理解是必要的。小鼠和人类在骨盆内具有相似的解剖标志，例如输尿管，直肠，膀胱，卵巢和圆形韧带⁹，以及USL与子宫，子宫颈和骶骨的相似交点。此外，小鼠提供了遗传操作的便利性，并有可能成为POP⁹研究的易于获得，具有成本效益的模型。

这项研究开发了一种从未生育（即从未怀孕）小鼠中获取和分离USL和不同盆底组织的方法。对提取的USL进行酶消化（即去除胶原蛋白和糖胺聚糖），测试以确定拉伸载荷下的机械响应，并在概念验证研究中评估生化成分。分离完整组织的能力将有助于进一步对骨盆底成分进行机械和生化表征，这是提高我们对分娩、怀孕和 POP 相关损伤风险的理解的关键第一步。

研究方案

所有动物实验和程序均根据科罗拉多大学博尔德分校动物护理和使用委员会批准的协议#2705进行。6周龄雌性C57BL / 6J小鼠用于本研究。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 动物制备

1. 按照机构批准的方法对动物实施安乐死。
   注意:本研究使用符合美国兽医协会指南的CO 2吸入（置换率为腔室体积的30%至70%，每分钟CO₂），然后颈椎脱位，以确保成功安乐死。
   1. 如果可能的话，在引擎盖下工作，以尽量减少小鼠过敏原的传播。一旦鼠标停止移动和呼吸，等待 2 分钟或更长时间以验证无反应。
      注意:如果小鼠怀孕或产后，幼崽必须单独安乐死。在解剖过程中，必须将幼犬 E15.5 及以上斩首。
2. 用解剖垫，11刀片手术刀，弯曲的细尖剪刀，两对镊子，弯曲的镊子，5-0聚乳糖缝合线，解剖显微镜和六个针准备解剖装置（图1，见 材料表）。
3. 将鼠标放在垫上，然后将前肢向下固定（图2A）。用剪刀在腹部切开约1-1.5厘米的切口（图2B）。轻轻地使用剪刀将切口的颅骨，尾部和侧面的皮肤分开（图2C，D）。
4. 将鼠标翻转到其背面，然后轻轻地将皮肤剥离到后肢，以将皮肤从解剖部位移开（图2E-H）。
5. 将鼠标固定在四肢上（图2I），并在腹部从胸部到骨盆切开约1厘米的切口（图2J）。
   注意:确保不要损坏下面的器官。
6. 轻轻地将器官推向胸部以清除视野（图2K）。
   注意:用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。
7. 清除骨盆底的所有脂肪组织（图2L-N）。
   注意:使用镊子轻轻拉出并清除感兴趣的器官和组织中的脂肪。

图 1:干净的工作区，包含执行解剖所需的所有工具。 请点击此处查看此图的大图。

图2:去除小鼠的皮肤并打开骨盆和胸腔。 （A）固定所有四肢。（B） 初始切口。（C）用剪刀将皮肤与下面的筋膜分开。（D）切割皮肤并准备去除。（E-G）通过绕过鼠标将皮肤拉下来。（H）从背侧完全去除皮肤。（I）从躯干上完全去除皮肤，并重新固定小鼠四肢。（J） 开腹。（K）开放腹部的视图。（L）将器官移出视野。（M） 去除脂肪。（N）清除的骨盆底视图。请点击此处查看此图的大图。

2. USL 收获

1. 从卵巢上切下子宫角（图3B），拉离视野，并在宫颈连接处切断（图3C）。
   注意:子宫角可以按照图 3A中的原理图进行识别。用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。
2. 将输尿管从膀胱连接处切开（图3D）。
   注意:这是为了避免与 USL 混淆。
3. 将结肠切得尽可能靠近子宫颈（图3E，F）。
   注意:用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。
4. 将鼠标和解剖垫一起放在解剖镜下方以可视化 USL（图 3G）。
5. 轻轻地用镊子清除USL周围的脂肪。
   注意:使用第二对镊子以小角度将子宫颈向上支撑，以增强USL与子宫颈相交位置的可视化。用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。
6. 在两个USL的颈端周围绑一条5-0多乳糖缝合线（图4B，C）。
   注意:可以使用原理图和放大图像识别 USL（图 4I-K）
7. 在这项研究中，一种USL用于形态学或生化分析（即拉曼显微镜，免疫组织化学，组织学）。切开USL的颈端，留下一块子宫颈附着，并从USL底部切下一块肌肉（图4D）。将解剖的组织放入具有1x PBS的浴中以保持组织水分（图4G，H）。
8. 使用剩余的 USL 进行机械测试和映像。切开USL的颈端，留下一块子宫颈，以方便机械设置（图4D）。
   注意:在机械测试期间，宫颈组织将充当固定USL的锚。
9. 一旦收获了所有感兴趣的组织（步骤3-5），将股骨从骨盆脱位（图4E）。
   注意:当股骨头与髋臼杯脱节时，应听到微弱的咔嗒声。
10. 从盆骨的远端和近端切开盆骨，留下约10毫米的总组织（图4F）。将解剖的组织置于1x PBS中。

图 3:用于 USL 解剖的清除盆底 。 （A）解剖示意图。（B）在卵巢连接处切割子宫角。（三）切掉子宫角。（D） 切断输尿管。（E） 切结肠。（F）直肠和USL的清晰视图。（G）将鼠标和解剖垫放在解剖镜下。 请点击此处查看此图的大图。

图4:USL和周围组织的视图以及USL的解剖。 （A）USL周围的解剖标志示意图。（B）在颈椎末端绑一根缝合线。（C）切掉USL的颈端。（D）切下USL以用于骶连接处的生化分析。（E）从盆骨上切开股骨。（F）切断骨盆的近端。（G）在35毫米培养皿中解剖USL。（H） USL与附着的骨盆在35毫米培养皿中。（I） 0.75倍放大倍率下的USL和直肠。（J） 去除USL中的脂肪。（K） 以1.0倍放大倍率清洁USL。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看此图的大图。

3. 膀胱摘取

1. 脂肪清除后，用镊子握住膀胱，并以大约40°的角度轻轻提起（图5A）。
2. 用剪刀从子宫颈正上方的远端切掉膀胱（图5B）。
3. 将组织放入具有1x PBS的浴中以保持组织水分（图5H）。

4. 直肠摘取术

1. 一旦 USL 与子宫颈断开并解剖膀胱，用镊子以大约 40° 的角度提起子宫颈。有连接直肠和子宫颈的直肠阴道筋膜。用手术刀轻轻切断这个连接（图5C，D）。
2. 用剪刀在耻骨联合处剪开耻骨。轻轻地扩大工作空间，以增加对组织插入物的视觉访问。
3. 用镊子轻轻地将直肠拉向胸部，然后用剪刀沿着直肠从其后侧到肛门。在肛门处切开直肠（图5E）。
4. 将组织置于1x PBS中以保持组织水分（图5I）。

5. 子宫颈阴道复合体摘取

1. 从子宫颈取出 USL 后，用镊子固定子宫颈。用剪刀尽可能靠近外阴剪开子宫颈（图5F，G）。
   注意:确保切开耻骨联合，以目视阴道远端。
2. 将组织置于1x PBS中以保持组织水分（图5J）。

图 5:膀胱、直肠和子宫颈/阴道夹层 。 （A） 保持膀胱一定角度。（B）切断膀胱。（C）切断连接子宫颈和直肠的肌腱。（D）1.0倍放大倍率下的肌腱。（E）切开直肠。（F）用镊子抓住子宫颈。（G）在阴道远端切开。（H）膀胱在35毫米培养皿中。（I）35毫米培养皿中的直肠。（J）35毫米培养皿中的子宫颈阴道组织复合物。 请点击此处查看此图的大图。

6. 用于组织表征的样品制备

1. USL的机械和视觉分析
   1. 将带有骨盆附件的USL放在定制染色孔内的T形壁上，以确保完全浸入染色溶液中（孔的CAD图纸可在补充编码文件1和补充编码文件2中找到）。
      注意:使用缝合线和镊子来帮助放置。
   2. 在2.5mL的1x PBS中稀释对游离胺基团（5μL，参见 材料表）进行染色的市售染料，将溶液添加到定制染色孔中，并在4°C的摇臂上染色组织2小时。
      注意:在将溶液添加到染色孔之前，请涡旋溶液。
   3. 在染色的最后 15 分钟内，向溶液中加入 2.5 μL 市售死细胞核染色剂（参见 材料表）。
      注意:在加入染色孔之前涡旋溶液。
2. USL的拉曼分析
   1. 将 USL 直线固定在定制孔中包含的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 块上。
      注意: PDMS 用作软基板，以便将样品固定在所需的配置中。通过按照制造商的说明（见 材料表）混合两种组分，在培养皿中铸造，并在聚合后用手术刀刀片将PDMS切割成所需的几何形状，可以制成不同尺寸的块。
   2. 在缝合环和骨盆肌肉处用昆虫针别针。用 1x PBS 水合组织。
3. 剩余组织
   1. 根据所需的分析，用液氮或适当的包埋化合物快速冷冻剩余的组织。
   2. 将组织保存在-80°C直至后续分析（例如，免疫组织化学或生化测定）。

结果

解剖野生型鼠标的每个步骤在与协议相关的相关视频和图中都有详细说明。在本研究中，使用6周龄雌性C57BL / 6J小鼠（补充表1）。分析了用不同酶处理USL的三个样品组:对照组（无处理组），胶原酶处理组和软骨素酶处理组。USL中的平滑肌，神经和淋巴管被富含原纤维胶原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）^的ECM包围5，这些物质被认为为组织提供机械完整性。选择酶处理来破坏?...

讨论

结构损伤对女性生殖组织的影响研究不足，需要一个易于访问的动物模型进行POP研究。小鼠是一种具有成本效益的模型，可以模仿人类生殖研究¹⁶。由于对女性生殖系统研究的兴趣日益浓厚，因此需要有助于研究这些组织的方法。为了满足这一需求，在这项工作中，建立了一种解剖和制备小鼠盆底组织以进行结构和功能分析的方法。

为了解剖的成功，需要足...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 Blade	Fisher	3120030	Removable blade
1x PBS	Fisher	BP399-1	Diluted from 10x concentration
Chondroitinase ABC	Sigma	C3667-10UN	Enzyme
Collagenase Type I	Worthington Biochemical	LS004194	Enzyme
Confocal Microscope	Leica	STELLARIS 5	Upright configuration
Dissection Microscope	Leica	S9E	With camera
Dumont #5 Forceps	Fisher	NC9626652	Thin tip
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #: 000664
FemtoTools Micromanipulator	FemtoTools	FT-RS1002	100 mN load cell
FST Curved Forceps	Fisher	NC9639443	Curved tip
FST Sharp 9 mm Scissors	Fisher	NC9639443	Dissection scissors
Ghost Dye 780	Tonbo	13-0865-T500	Free amine stain
Kimwipes	Fisher	06-666	Box of 50 wipes
OCT	Tissue Tek	4583	Used for tissue preservation
PDMS	Thermo Fisher	044764.AK	Follow manufacturer's instructions
Petri Dishes 35 mm	Fisher	FB0875711A	Used for dissected tissue
Polyglactin 5-0 Suture	Veter.Sut	VS385VL	With needle
Renishaw InVia Raman Microscope	Renishaw	PN192(EN)-02-A	With confocal objectives
Rocking Platform	VWR	10127-876	2 tier platform
Surgical Gloves	Fisher	52818	For dissection
Sytox	Thermo Fisher	S11381	Nuclear stain
T-pins	Fisher	S99385	For dissection
Transfer Pipets	Fisher	13-711-7M	For dissection
Underpads	Fisher	22037950	To cover dissection pad