小鼠子宫骶韧带和盆底器官的分离和表征

摘要

本文提出了解剖子宫骶韧带和其他盆底组织（包括小鼠的子宫颈、直肠和膀胱）的详细方案，以扩大对女性生殖组织的研究。

摘要

盆腔器官脱垂 （POP） 是一种影响盆底完整性、结构和机械支撑的疾病。骨盆底的器官由不同的解剖结构支撑，包括肌肉、韧带和骨盆筋膜。子宫骶韧带 （USL） 是一种关键的承重结构，USL 损伤导致发生 POP 的风险更高。本协议描述了小鼠USL和盆底器官的解剖，以及使用拉曼光谱获取有关USL生化组成和功能的独特数据以及机械行为的评估。小鼠是临床前研究的宝贵模型，但解剖小鼠USL是一个困难而复杂的过程。该程序提供了一种指导解剖鼠盆底组织（包括USL）的方法，以实现多种评估和表征。这项工作旨在帮助基础科学家和工程师解剖盆底组织，从而扩大USL和盆底条件研究以及使用小鼠模型进行女性健康的临床前研究的可及性。

引言

大约 50% 的女性受盆腔器官脱垂 （^{POP） 的影响}1^，2。这些女性中约有11%符合接受手术修复的标准，成功率很低（~30%）^3，4。POP的特征是由于USL和盆底肌肉无法提供足够的支撑，任何或所有盆腔器官（即膀胱，子宫，子宫颈和直肠）从其自然位置下降⁵。除了诱发因素³，⁶外，这种情况还涉及解剖功能障碍和结缔组织的破坏^，以及神经肌肉损伤。POP 与多种因素相关，例如年龄、体重、胎次和分娩类型（即阴道分娩或剖腹产）。这些因素被认为会影响所有盆底组织的机械完整性，怀孕和胎次被认为是POP⁵，^7，8的主要驱动因素。

子宫骶韧带 （USL） 是子宫、子宫颈和阴道的重要支撑结构，并将子宫颈与骶骨相连⁴.对USL的损害使妇女患POP的风险增加。据信，怀孕和分娩....

研究方案

所有动物实验和程序均根据科罗拉多大学博尔德分校动物护理和使用委员会批准的协议#2705进行。6周龄雌性C57BL / 6J小鼠用于本研究。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 动物制备

1. 按照机构批准的方法对动物实施安乐死。
   注意：本研究使用符合美国兽医协会指南的CO 2吸入（置换率为腔室体积的30%至70%，每分钟CO₂），然后颈椎脱位，以确保成功安乐死。
   1. 如果可能的话，在引擎盖下工作，以尽量减少小鼠过敏原的传播。一旦鼠标停止移动和呼吸，等待 2 分钟或更长时间以验证无反应。
      注意：如果小鼠怀孕或产后，幼崽必须单独安乐死。在解剖过程中，必须将幼犬 E15.5 及以上斩首。
2. 用解剖垫，11刀片手术刀，弯曲的细尖剪刀，两对镊子，弯曲的镊子，5-0聚乳糖缝合线，解剖显微镜和六个针准备解剖装置（图1，见 材料表）。
3. 将鼠标放在垫上，然后将前肢向下固定（图2A）。用剪刀在腹部切开约1-1.5厘米的切口（图2B）。轻轻地使用剪刀将切口的颅骨，尾部和....

结果

解剖野生型鼠标的每个步骤在与协议相关的相关视频和图中都有详细说明。在本研究中，使用6周龄雌性C57BL / 6J小鼠（补充表1）。分析了用不同酶处理USL的三个样品组：对照组（无处理组），胶原酶处理组和软骨素酶处理组。USL中的平滑肌，神经和淋巴管被富含原纤维胶原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）^的ECM包围5，这些物质被认为为组织提供机械完整性。选择酶处理来破坏.......

讨论

结构损伤对女性生殖组织的影响研究不足，需要一个易于访问的动物模型进行POP研究。小鼠是一种具有成本效益的模型，可以模仿人类生殖研究¹⁶。由于对女性生殖系统研究的兴趣日益浓厚，因此需要有助于研究这些组织的方法。为了满足这一需求，在这项工作中，建立了一种解剖和制备小鼠盆底组织以进行结构和功能分析的方法。

为了解剖的成功，需要足.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 Blade	Fisher	3120030	Removable blade
1x PBS	Fisher	BP399-1	Diluted from 10x concentration
Chondroitinase ABC	Sigma	C3667-10UN	Enzyme
Collagenase Type I	Worthington Biochemical	LS004194	Enzyme
Confocal Microscope	Leica	STELLARIS 5	Upright configuration
Dissection Microscope	Leica	S9E	With camera
Dumont #5 Forceps	Fisher	NC9626652	Thin tip
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #: 000664
FemtoTools Micromanipulator	FemtoTools	FT-RS1002	100 mN load cell
FST Curved Forceps	Fisher	NC9639443	Curved tip
FST Sharp 9 mm Scissors	Fisher	NC9639443	Dissection scissors
Ghost Dye 780	Tonbo	13-0865-T500	Free amine stain
Kimwipes	Fisher	06-666	Box of 50 wipes
OCT	Tissue Tek	4583	Used for tissue preservation
PDMS	Thermo Fisher	044764.AK	Follow manufacturer's instructions
Petri Dishes 35 mm	Fisher	FB0875711A	Used for dissected tissue
Polyglactin 5-0 Suture	Veter.Sut	VS385VL	With needle
Renishaw InVia Raman Microscope	Renishaw	PN192(EN)-02-A	With confocal objectives
Rocking Platform	VWR	10127-876	2 tier platform
Surgical Gloves	Fisher	52818	For dissection
Sytox	Thermo Fisher	S11381	Nuclear stain
T-pins	Fisher	S99385	For dissection
Transfer Pipets	Fisher	13-711-7M	For dissection
Underpads	Fisher	22037950	To cover dissection pad