Выделение и характеристика маточно-крестцовых связок и органов тазового дна у мышей

Резюме

В этой статье представлен подробный протокол рассечения маточно-крестцовых связок и других тканей тазового дна, включая шейку матки, прямую кишку и мочевой пузырь у мышей, для расширения изучения женских репродуктивных тканей.

Аннотация

Пролапс тазовых органов (POP) — это состояние, которое влияет на целостность, структуру и механическую поддержку тазового дна. Органы тазового дна поддерживаются различными анатомическими структурами, включая мышцы, связки и тазовые фасции. Маточно-крестцовая связка (УЗЛ) является критической несущей конструкцией, и повреждение УЗЛ приводит к более высокому риску развития СОЗ. В настоящем протоколе описывается вскрытие УЗЛ мышей и органов тазового дна, а также получение уникальных данных о биохимическом составе и функции УЗЛ с использованием рамановской спектроскопии и оценки механического поведения. Мыши являются бесценной моделью для доклинических исследований, но препарирование мышиного USL является трудным и запутанным процессом. Эта процедура представляет собой подход, направленный на диссекцию тканей тазового дна мышей, включая USL, для проведения множественных оценок и характеристик. Эта работа направлена на то, чтобы помочь фундаментальным ученым и инженерам в рассечении тканей тазового дна, тем самым расширяя доступность исследований USL и состояний тазового дна, а также доклинических исследований женского здоровья с использованием мышиных моделей.

Введение

Примерно 50% женщин страдают пролапсом тазовых органов (СОЗ)^1,2. Около 11% этих женщин соответствуют критериям хирургического вмешательства, которое имеет низкий уровень успеха (~ 30%)^3,4. СОЗ характеризуется опущением любого или всех органов малого таза (т.е. мочевого пузыря, матки, шейки матки и прямой кишки) из их естественного положения из-за неспособности USL и мышц тазового дна обеспечить адекватную поддержку⁵. Это состояние включает анатомическую дисфункцию и разрушение соединительной ткани, а также нервно-мышечное повреждение, в дополнение к предрасполагающим факторам ^3,6. СОЗ связан с множеством факторов, таких как возраст, вес, паритет и тип родов (например, вагинальные или кесарево сечение). Считается, что эти факторы влияют на механическую целостность всех тканей тазового дна, при этом беременность и паритет считаются основными факторами POP ^5,7,8.

Маточно-крестцовые связки (USL) являются важными поддерживающими структурами для матки, шейки матки и влагалища и связывают шейку матки с крестцом⁴. Повреждение USL подвергает женщин повышенному риску развития СОЗ. Считается, что беременность и роды накладывают дополнительную нагрузку на USL, что потенциально вызывает травму и увеличивает вероятность СОЗ. USL представляет собой сложную ткань, состоящую из гладкомышечных клеток, кровеносных сосудов и лимфатических сосудов, неоднородно распределенных вдоль связки, которые можно разделить на три отдельных отдела: шейный, промежуточный и крестцовый регион⁹. Механическая целостность USL обусловлена компонентами внеклеточного матрикса (ECM), такими как коллагены, эластин и протеогликаны ^5,9,10. Известно, что коллагеновые волокна типа I являются основным несущим растягивающим компонентом связочных тканей и, следовательно, вероятно, участвуют в разрушении USL и POP¹¹.

Существует недостаток знаний о причинах, распространенности и последствиях СОЗ у женщин. Разработка соответствующей модели СОЗ на животных необходима для углубления нашего понимания женского тазового дна. Мыши и люди имеют сходные анатомические ориентиры в тазу, такие как мочеточники, прямая кишка, мочевой пузырь, яичники и круглые связки⁹, а также сходные точки пересечения USL с маткой, шейкой матки и крестцом. Кроме того, мыши обеспечивают простоту генетических манипуляций и могут стать легкодоступной и экономически эффективной моделью для изучения СОЗ⁹.

В этом исследовании был разработан метод доступа и изоляции USL и различных тканей тазового дна у нерожавших (т.е. никогда не беременных) мышей. Экстрагированные USL подвергали ферментативному расщеплению (т.е. удалению коллагенов и гликозаминогликанов), тестировали для определения механической реакции при растягивающей нагрузке и оценивали биохимический состав в экспериментальном исследовании. Способность изолировать неповрежденные ткани будет способствовать дальнейшим механическим и биохимическим характеристикам компонентов тазового дна, что является важным первым шагом на пути к улучшению нашего понимания рисков травм, связанных с родами, беременностью и СОЗ.

протокол

Все эксперименты и процедуры на животных проводились в соответствии с протоколом #2705, одобренным Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Колорадо в Боулдере. Для настоящего исследования были использованы шестинедельные самки мышей C57BL / 6J. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка животных

1. Усыпьте животное в соответствии с официально утвержденным методом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовалась ингаляция CO 2 в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (скорость смещения от 30% до 70% объема камеры с CO₂ в минуту) с последующим вывихом шейки матки для обеспечения успешной эвтаназии.
   1. Работайте под капотом, если это возможно, чтобы свести к минимуму распространение мышей аллергенов. Как только мышь перестанет двигаться и дышать, подождите 2 минуты или более, чтобы убедиться в отсутствии ответа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь беременна или находится в послеродовом периоде, щенки должны быть индивидуально усыплены. Щенки E15.5 и старше должны быть обезглавлены во время вскрытия.
2. Подготовьте установку для вскрытия с помощью диссекционной подушечки, скальпеля с 11 лезвиями, изогнутых тонких острых ножниц, двух пар щипцов, изогнутых щипцов, полиглактинового шва 5-0, препарирующего микроскопа и шести штифтов (рис. 1, см. Таблицу материалов).
3. Поместите мышь на коврик и прижмите передние конечности (рисунок 2A). Сделайте разрез примерно 1-1,5 см в области живота ножницами (рис. 2Б). Аккуратно используйте ножницы, чтобы отделить кожу на краниальной, каудальной и боковой сторонах разреза (рис. 2C, D).
4. Переверните мышь на спинную сторону и осторожно оттяните кожу к задним конечностям, чтобы удалить кожу с места рассечения (рис. 2E-H).
5. Прижмите мышь к конечностям (рис. 2I) и сделайте разрез примерно на 1 см в брюшной полости от грудной клетки до таза (рис. 2J).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не повредить нижележащие органы.
6. Осторожно подтолкните органы к грудной клетке, чтобы очистить поле зрения (рис. 2K).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Орошите ткани 1x PBS для поддержания гидратации.
7. Очистите тазовое дно от всей жировой ткани (рис. 2L-N).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте щипцы, чтобы аккуратно вытянуть и очистить от жира интересующие органы и ткани.

Рисунок 1: Чистое рабочее пространство со всеми инструментами, необходимыми для выполнения вскрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Удаление кожи и вскрытие тазовой и грудной полостей мыши. (А) Придавливание всех конечностей. (B) Начальный разрез. (C) Отделение кожи от нижележащей фасции с помощью ножниц. (D) Срезание кожи и подготовка к удалению. (Э-Г) Стягивание кожи, обходя мышь. (H) Полное удаление кожи со спинной стороны. (I) Полное снятие кожи с туловища и повторное закрепление конечностей мыши. (J) Вскрытие брюшной полости. (K) Вид на открытую брюшную полость. (L) Выведение органов из поля зрения. (М) Удаление жира. (N) Вид очищенного тазового дна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Сбор урожая USL

1. Отрежьте рога матки от яичников (рис. 3В), отодвиньте от поля зрения и отрежьте в месте шейного соединения (рис. 3В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рога матки можно идентифицировать по схеме на рисунке 3А. Орошите ткани 1x PBS для поддержания гидратации.
2. Отрежьте мочеточники от соединения мочевого пузыря (рис. 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это сделано для того, чтобы избежать путаницы с USL.
3. Разрежьте толстую кишку как можно ближе к шейке матки (рис. 3E, F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Орошите ткани 1x PBS для поддержания гидратации.
4. Поместите мышь вместе с диссекционной площадкой под препарирующий прицел, чтобы визуализировать USL (рис. 3G).
5. Аккуратно используйте щипцы, чтобы очистить окружающий жир от USL.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вторую пару щипцов, чтобы удерживать шейку матки под небольшим углом, чтобы улучшить визуализацию места пересечения USL с шейкой матки. Орошите ткани 1x PBS для поддержания гидратации.
6. Завяжите полиглактиновый шов 5-0 вокруг шейного конца обоих USL (рис. 4B, C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: USL можно идентифицировать по схематическим изображениям и изображениям увеличения (рис. 4I-K)
7. В этом исследовании один USL используется для морфологических или биохимических анализов (т.е. рамановской микроскопии, иммуногистохимии, гистологии). Отрежьте шейный конец USL, оставив прикрепленным кусочек шейки матки, и отрежьте кусочек мышцы от нижней части USL (рис. 4D). Поместите рассеченную ткань в ванну с 1x PBS, чтобы сохранить ткань увлажненной (рис. 4G, H).
8. Используйте оставшийся USL для механических испытаний и визуализации. Отрежьте шейный конец USL, оставив прикрепленным кусок шейки матки, чтобы облегчить механическую настройку (рис. 4D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань шейки матки будет действовать как якорь для закрепления USL во время механического испытания.
9. После того, как все интересующие ткани будут собраны (этапы 3-5), вывихните бедренные кости из таза (рис. 4E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует услышать слабый щелкающий звук, когда головка бедренной кости отделена от вертлужной впадины.
10. Отрежьте тазовую кость от дистального и проксимального концов тазовой кости, оставив около 10 мм общей ткани (рис. 4F). Поместите рассеченную ткань в 1x PBS.

Рисунок 3: Очищенное тазовое дно для рассечения USL . (А) Схема анатомии. (Б) Обрезание рогов матки в месте соединения яичников. (С) Отсечение рогов матки. (D) Сокращение мочеточников. (E) Разрезание толстой кишки. (F) Четкое представление о прямой кишке и USL. (G) Размещение мыши и вскрытия под препарирующей областью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Вид USL и окружающих тканей и вскрытие USL. (A) Схема анатомических ориентиров, окружающих USL. (B) Наложение шва на кончики шейки матки. (C) Отрезание шейных концов USL. (D) Отрезание USL для использования для биохимических анализов в сакральной связи. (E) Отрезание бедренной кости от тазовой кости. (F) Отсечение проксимального конца таза. (G) Препарирование USL в чашке Петри диаметром 35 мм. (H) USL с прикрепленным тазом в чашке Петри диаметром 35 мм. (I) USL и прямая кишка при 0,75-кратном увеличении. (J) Удаление жира из USL. (K) Очистка USL при 1,0-кратном увеличении. Масштабная линейка = 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Забор мочевого пузыря

1. После того, как жир очистится, возьмитесь за мочевой пузырь щипцами и осторожно поднимите его под углом примерно 40° (рис. 5A).
2. Ножницами отрежьте мочевой пузырь с дистальной стороны, прямо над шейкой матки (рис. 5B).
3. Поместите салфетку в ванну с 1x PBS, чтобы ткань оставалась увлажненной (рис. 5H).

4. Забор прямой кишки

1. После того, как USL отсоединены от шейки матки и мочевой пузырь рассечен, поднимите шейку матки под углом примерно 40° щипцами. Существует ректовагинальная фасция, которая соединяет прямую кишку и шейку матки. Скальпелем аккуратно разрежьте это соединение (рис. 5В, Г).
2. Разрежьте лобковую кость в месте лобкового симфиза с помощью ножниц. Аккуратно расширьте рабочее пространство, чтобы увеличить визуальный доступ к тканям.
3. С помощью щипцов осторожно потяните прямую кишку к грудной клетке и используйте ножницы, чтобы проследить прямую кишку от задней стороны до ануса. Разрежьте прямую кишку в области заднего прохода (рис. 5Е).
4. Поместите салфетку в 1x PBS, чтобы ткань оставалась увлажненной (рис. 5I).

5. Комплексный забор шейки матки и влагалища

1. После того, как USL будут удалены из шейки матки, используйте щипцы, чтобы удерживать шейку матки. Разрежьте шейку матки как можно ближе к вульве с помощью ножниц (рис. 5F, G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно разрезайте лобковый симфиз, чтобы визуально увидеть дистальный конец влагалища.
2. Поместите салфетку в 1x PBS, чтобы ткань оставалась увлажненной (рис. 5J).

Рисунок 5: Расслоения мочевого пузыря, прямой кишки и шейки матки / влагалища . (А) Удержание мочевого пузыря под углом. (Б) Отсечение мочевого пузыря. (C) Разрезание сухожилия, соединяющего шейку матки и прямую кишку. (D) Сухожилие при 1,0-кратном увеличении. (E) Разрезание прямой кишки. (F) Держание за шейку матки щипцами. (G) Разрез в дистальном конце влагалища. (H) Мочевой пузырь в чашке Петри диаметром 35 мм. (I) Прямая кишка в чашке Петри диаметром 35 мм. (J) Комплекс тканей шейки матки и влагалища в чашке Петри диаметром 35 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Пробоподготовка для характеристики тканей

1. Механический и визуальный анализ USL
   1. Поместите USL с тазовым креплением на Т-образную стенку в специальном окрашивающем колодце, чтобы обеспечить полное погружение в окрашивающий раствор (чертежи САПР лунки можно найти в файле дополнительного кодирования 1 и файле дополнительного кодирования 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте швы и щипцы, чтобы помочь с размещением.
   2. Разбавьте имеющийся в продаже краситель, окрашивающий свободные аминогруппы (5 мкл, см. Таблицу материалов), в 2,5 мл 1x PBS, добавьте раствор в специальное окрашивание и окрашивайте ткань в течение 2 ч на коромысле при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перемешайте раствор перед добавлением его в лунку для окрашивания.
   3. В течение последних 15 мин окрашивания добавьте в раствор 2,5 мкл коммерчески доступного окрашивания ядер мертвых клеток (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перемешайте раствор перед добавлением в окрашивающую лунку.
2. Рамановский анализ USL
   1. Закрепите USL по прямой линии на блоке полидиметилсилоксана (PDMS), который содержится в специальной скважине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS используется в качестве мягкой подложки для закрепления образца в желаемой конфигурации. Блоки различных размеров могут быть изготовлены путем смешивания двух компонентов в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов), литья в чашке Петри и, после полимеризации, резки PDMS до требуемой геометрии с помощью лезвия скальпеля.
   2. Приколите булавками от насекомых на шовной петле и на мышце таза. Увлажните ткань с помощью 1x PBS.
3. Остальные ткани
   1. Заморозьте оставшиеся ткани жидким азотом или в соответствующем составе, в зависимости от желаемого анализа.
   2. Сохраняют ткани при температуре -80 °C до последующих анализов (например, иммуногистохимических или биохимических анализов).

Результаты

Каждый шаг вскрытия мыши дикого типа подробно описан в соответствующем видео и рисунках, связанных с протоколом. Для этого исследования были использованы 6-недельные самки мышей C57BL/6J (Дополнительная таблица 1). Были проанализированы три группы образцов с USL, обработанные разли?...

Обсуждение

Влияние структурных повреждений на женские репродуктивные ткани недостаточно изучено, и для исследований СОЗ необходима легкодоступная модель на животных. Мышь является экономически эффективной моделью, которая может имитировать репродуктивные исследования человека¹⁶....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 Blade	Fisher	3120030	Removable blade
1x PBS	Fisher	BP399-1	Diluted from 10x concentration
Chondroitinase ABC	Sigma	C3667-10UN	Enzyme
Collagenase Type I	Worthington Biochemical	LS004194	Enzyme
Confocal Microscope	Leica	STELLARIS 5	Upright configuration
Dissection Microscope	Leica	S9E	With camera
Dumont #5 Forceps	Fisher	NC9626652	Thin tip
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #: 000664
FemtoTools Micromanipulator	FemtoTools	FT-RS1002	100 mN load cell
FST Curved Forceps	Fisher	NC9639443	Curved tip
FST Sharp 9 mm Scissors	Fisher	NC9639443	Dissection scissors
Ghost Dye 780	Tonbo	13-0865-T500	Free amine stain
Kimwipes	Fisher	06-666	Box of 50 wipes
OCT	Tissue Tek	4583	Used for tissue preservation
PDMS	Thermo Fisher	044764.AK	Follow manufacturer's instructions
Petri Dishes 35 mm	Fisher	FB0875711A	Used for dissected tissue
Polyglactin 5-0 Suture	Veter.Sut	VS385VL	With needle
Renishaw InVia Raman Microscope	Renishaw	PN192(EN)-02-A	With confocal objectives
Rocking Platform	VWR	10127-876	2 tier platform
Surgical Gloves	Fisher	52818	For dissection
Sytox	Thermo Fisher	S11381	Nuclear stain
T-pins	Fisher	S99385	For dissection
Transfer Pipets	Fisher	13-711-7M	For dissection
Underpads	Fisher	22037950	To cover dissection pad