Murin uterosakral ligamentlerin ve pelvik taban organlarının izolasyonu ve karakterizasyonu

Özet

Bu makalede, kadın üreme dokularının çalışmasını genişletmek için farelerde uterosakral ligamentlerin ve serviks, rektum ve mesane dahil olmak üzere diğer pelvik taban dokularının diseksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Pelvik organ prolapsusu (POP), pelvik tabanın bütünlüğünü, yapısını ve mekanik desteğini etkileyen bir durumdur. Pelvik tabandaki organlar kaslar, bağlar ve pelvik fasyalar dahil olmak üzere farklı anatomik yapılar tarafından desteklenir. Uterosakral ligament (USL) kritik bir yük taşıyıcı yapıdır ve USL'nin yaralanması POP gelişme riski daha yüksektir. Bu protokol, murin USL'lerinin ve pelvik taban organlarının diseksiyonunun yanı sıra, Raman spektroskopisi kullanılarak USL biyokimyasal bileşimi ve fonksiyonu hakkında benzersiz verilerin elde edilmesini ve mekanik davranışın değerlendirilmesini açıklamaktadır. Fareler klinik öncesi araştırmalar için paha biçilmez bir modeldir, ancak murin USL'yi diseksiyonu zor ve karmaşık bir süreçtir. Bu prosedür, USL de dahil olmak üzere murin pelvik taban dokularının diseksiyonuna rehberlik etmek için çoklu değerlendirme ve karakterizasyona olanak tanıyan bir yaklaşım sunmaktadır. Bu çalışma, pelvik taban dokularının temel bilim adamları ve mühendisler tarafından diseksiyonuna yardımcı olmayı, böylece USL ve pelvik taban koşulları üzerine yapılan araştırmaların erişilebilirliğini ve fare modellerini kullanarak kadın sağlığının klinik öncesi çalışmasını genişletmeyi amaçlamaktadır.

Giriş

Kadınların yaklaşık %50'si pelvik organ prolapsusundan (POP) ^etkilenir1,2. Bu kadınların yaklaşık %11'i, düşük bir başarı oranına (~%30) sahip olan cerrahi onarım kriterlerine uymaktadır ^3,4. POP, USL ve pelvik taban kaslarının yeterli desteği sağlayamaması nedeniyle pelvik organların (yani mesane, uterus, serviks ve rektum) herhangi birinin veya tamamının doğal pozisyonlarından inmesi ile karakterizedir⁵. Bu durum, predispozan faktörlere ek olarak anatomik disfonksiyon ve bağ dokusunun bozulmasının yanı sıra nöromüsküler hasarı da içerir ^3,6. POP, yaş, kilo, parite ve doğum şekli (yani vajinal veya sezaryen doğumlar) gibi birçok faktörle ilişkilidir. Bu faktörlerin tüm pelvik taban dokularının mekanik bütünlüğünü etkilediği düşünülmektedir, gebelik ve paritenin POP ^5,7,8'in ana itici güçleri olduğu düşünülmektedir.

Uterosakral ligamentler (USL'ler) uterus, serviks ve vajina için önemli destekleyici yapılardır ve serviksi sakrum^4'e bağlar. USL'lere verilen hasar, kadınları POP geliştirme riskine sokar. Hamilelik ve doğumun, USL'ye potansiyel olarak yaralanmaya neden olan ve POP şansını artıran ek bir baskı oluşturduğuna inanılmaktadır. USL, ligament boyunca heterojen olarak dağılmış düz kas hücreleri, kan damarları ve lenfatiklerden oluşan karmaşık bir dokudur ve üç ayrı bölüme ayrılabilir: servikal, orta ve sakral bölge⁹. USL'nin mekanik bütünlüğü, kollajenler, elastin ve proteoglikanlar gibi hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinden türetilir 5,9,10. Tip I kollajen liflerinin, ligamentöz dokuların önemli bir yük taşıyan gerilme bileşeni olduğu bilinmektedir ve bu nedenle muhtemelen USL yetmezliği ve POP¹¹ ile ilgilidir.

Kadınlarda POP'un nedenleri, prevalansı ve etkileri hakkında bilgi eksikliği vardır. Uygun bir POP hayvan modelinin geliştirilmesi, kadın pelvik tabanı hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için gereklidir. Fareler ve insanlar, pelvis içinde üreterler, rektum, mesane, yumurtalıklar ve yuvarlak bağlar⁹ gibi benzer anatomik işaretlere ve USL'nin uterus, serviks ve sakrum ile benzer kesişme noktalarına sahiptir. Ayrıca, fareler genetik manipülasyon kolaylığı sunar ve POP⁹ çalışması için kolayca erişilebilir, uygun maliyetli bir model olma potansiyeline sahiptir.

Bu çalışma, USL'ye ve farklı pelvik taban dokularına nullipar (yani asla hamile olmayan) farelerden erişmek ve izole etmek için bir yöntem geliştirdi. Ekstrakte edilen USL'ler enzimatik sindirime tabi tutuldu (yani, kollajenleri ve glikozaminoglikanları çıkarmak için), çekme yükü altında mekanik tepkiyi belirlemek için test edildi ve bir kavram kanıtı çalışmasında biyokimyasal bileşim için değerlendirildi. Bozulmamış dokuları izole etme yeteneği, pelvik taban bileşenlerinin daha fazla mekanik ve biyokimyasal karakterizasyonunu kolaylaştıracaktır, bu da doğum, hamilelik ve POP ile ilgili yaralanma riskleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yönelik çok önemli bir ilk adımdır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri, Colorado Boulder Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokol # 2705'e göre gerçekleştirildi. Bu çalışmada altı haftalık dişi C57BL/6J fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Hayvan hazırlama

1. Kurumsal olarak onaylanmış yöntemi izleyerek hayvanı ötenazi yapın.
   NOT: Bu çalışma, başarılı ötenaziyi sağlamak için Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin kılavuzlarına (dakikada CO₂ ile oda hacminin% 30 ila% 70'lik bir yer değiştirme oranı) uygun olarak CO₂ inhalasyonunu ve ardından servikal çıkığı kullanmıştır.
   1. Mümkünse, fare alerjenlerinin yayılmasını en aza indirmek için bir başlık altında çalışın. Fare hareket etmeyi ve nefes almayı bıraktığında, yanıt eksikliğini doğrulamak için 2 dakika veya daha fazla bekleyin.
      NOT: Fare hamileyse veya doğum sonrasıysa, yavrular ayrı ayrı ötenazi yapılmalıdır. E15.5 ve daha yaşlı yavruların diseksiyon sırasında başları kesilmelidir.
2. Diseksiyon düzeneğini bir diseksiyon pedi, 11 bıçaklı bir neşter, kavisli ince keskin makas, iki çift forseps, kavisli forseps, 5-0 poliglactin sütürü, bir diseksiyon mikroskobu ve altı pim ile hazırlayın (Şekil 1, bkz.
3. Fareyi pedin üzerine getirin ve ön ayakları aşağı doğru sabitleyin (Şekil 2A). Makasla karın içinde yaklaşık 1-1,5 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 2B). Kesinin kraniyal, kaudal ve lateral taraflarındaki cildi ayırmak için makası nazikçe kullanın (Şekil 2C, D).
4. Fareyi sırt tarafına çevirin ve cildi diseksiyon bölgesinden uzaklaştırmak için cildi arka bacaklara doğru yavaşça soyun (Şekil 2E-H).
5. Fareyi uzuvlara sabitleyin (Şekil 2I) ve göğüs kafesinden pelvise kadar karın içine yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 2J).
   NOT: Altta yatan organlara zarar vermediğinizden emin olun.
6. Görüş alanını temizlemek için organları yavaşça göğüs kafesine doğru itin (Şekil 2K).
   NOT: Hidrasyonu korumak için dokuları 1x PBS ile sulayın.
7. Pelvik tabandaki tüm yağ dokusunu temizleyin (Şekil 2L-N).
   NOT: İlgili organ ve dokulardaki yağları nazikçe çekmek ve temizlemek için forseps kullanın.

Şekil 1: Diseksiyonları gerçekleştirmek için gereken tüm araçlara sahip temiz bir çalışma alanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Cildin çıkarılması ve farenin pelvik ve torasik boşluklarının açılması. (A) Tüm uzuvları sabitlemek. (B) İlk insizyon. (C) Makas kullanarak derinin altta yatan fasyadan ayrılması. (D) Cildin kesilmesi ve çıkarılmaya hazırlanması. (E-G) Farenin etrafında dolaşarak cildi çekmek. (H) Cildin sırt tarafından tamamen çıkarılması. (I) Cildin gövdeden tamamen çıkarılması ve fare uzuvlarının yeniden sabitlenmesi. (J) Karnın açılması. (K) Açık karın görünümü. (L) Organları görüş alanı dışına taşımak. (M) Yağın uzaklaştırılması. (N) Temizlenmiş pelvik tabanın görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. USL hasadı

1. Rahim boynuzlarını yumurtalıklardan kesin (Şekil 3B), görüş alanından uzaklaştırın ve servikal bağlantıdan kesin (Şekil 3C).
   NOT: Rahim boynuzları Şekil 3A'daki şematik izlenerek tanımlanabilir. Hidrasyonu korumak için dokuları 1x PBS ile sulayın.
2. Üreterleri mesane bağlantısından uzaklaştırın (Şekil 3D).
   NOT: Bu, USL ile karışıklığı önlemek içindir.
3. Kolonu servikse mümkün olduğunca yakın kesin (Şekil 3E, F).
   NOT: Hidrasyonu korumak için dokuları 1x PBS ile sulayın.
4. USL'leri görselleştirmek için fareyi diseksiyon pedi ile birlikte diseksiyon kapsamının altına yerleştirin (Şekil 3G).
5. Çevredeki yağları USL'lerden temizlemek için forsepsleri yavaşça kullanın.
   NOT: USL'nin serviks ile kesiştiği yerin görselleştirilmesini geliştirmek için serviksi küçük bir açıyla tutmak için ikinci bir forseps çifti kullanın. Hidrasyonu korumak için dokuları 1x PBS ile sulayın.
6. Her iki USL'nin servikal ucunun etrafına 5-0 poliglactin sütürü bağlayın (Şekil 4B, C).
   NOT: USL'ler şematik ve büyütme görüntüleri kullanılarak tanımlanabilir (Şekil 4I-K)
7. Bu çalışmada, morfolojik veya biyokimyasal analizler (yani Raman mikroskobu, immünohistokimya, histoloji) için bir USL kullanılmıştır. USL'nin servikal ucunu kesin, serviksin bir parçasını bağlı bırakın ve USL'nin altından bir kas parçası kesin (Şekil 4D). Disseke edilmiş dokuyu, dokuyu nemli tutmak için 1x PBS içeren bir banyoya yerleştirin (Şekil 4G, H).
8. Mekanik test ve görüntüleme için kalan USL'yi kullanın. Mekanik kurulumu kolaylaştırmak için USL'nin servikal ucunu kesin, bir serviks parçasını bağlı bırakın (Şekil 4D).
   NOT: Servikal doku, mekanik test sırasında USL'yi sabitlemek için bir çapa görevi görecektir.
9. İlgilenilen tüm dokular toplandıktan sonra (adım 3-5), femurları pelvisten çıkarın (Şekil 4E).
   NOT: Femur başı asetabuler kaptan ayrıldığında hafif bir tıklama sesi duyulmalıdır.
10. Pelvik kemiği pelvik kemiğin distal ve proksimal uçlarından keserek yaklaşık 10 mm toplam doku bırakın (Şekil 4F). Disseke edilmiş dokuyu 1x PBS'ye yerleştirin.

Şekil 3: USL diseksiyonu için temizlenmiş pelvik taban . (A) Anatominin şeması. (B) Yumurtalık bağlantısında uterus boynuzlarının kesilmesi. (C) Rahim boynuzlarının kesilmesi. (D) Üreterlerin kesilmesi. (E) Kolonun kesilmesi. (F) Rektum ve USL'lerin net bir görünümü. (G) Fare ve diseksiyon pedinin diseksiyon kapsamının altına yerleştirilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: USL ve çevresindeki dokuların görünümü ve USL'lerin diseksiyonu. (A) USL'yi çevreleyen anatomik işaretlerin şeması. (B) Servikal uçların etrafına bir dikiş bağlamak. (C) USL'nin servikal uçlarının kesilmesi. (D) Sakral bağlantıdaki biyokimyasal analizler için kullanılmak üzere USL'nin kesilmesi. (E) Femurların pelvik kemikten kesilmesi. (F) Pelvisin proksimal ucunun kesilmesi. (G) USL'nin 35 mm'lik bir Petri kabında diseke edilmesi. (H) 35 mm'lik bir petri kabında pelvisi takılı USL. (I) USL ve rektum 0.75x büyütmede. (J) USL'den yağ alınması. (K) USL'lerin 1,0x büyütmede temizlenmesi. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Mesane hasadı

1. Yağ temizlendikten sonra, mesaneyi forseps ile tutun ve yaklaşık 40 ° 'lik bir açıyla yavaşça kaldırın (Şekil 5A).
2. Makasla, mesaneyi distal taraftan, rahim ağzının hemen üstünden dilimleyin (Şekil 5B).
3. Dokuyu nemli tutmak için dokuyu 1x PBS ile bir banyoya yerleştirin (Şekil 5H).

4. Rektum hasadı

1. USL'lerin serviksle bağlantısı kesildikten ve mesane diseke edildikten sonra, serviksi forseps ile yaklaşık 40 ° 'lik bir açıyla kaldırın. Rektum ve serviksi birbirine bağlayan rektovajinal fasya vardır. Neşterle bu bağlantıyı yavaşça kesin (Şekil 5C, D).
2. Kasık kemiğini kasık simfizinde makas kullanarak kesin. Doku yerleştirmelerine görsel erişimi artırmak için çalışma alanını yavaşça genişletin.
3. Forsepsle, rektumu yavaşça toraksa doğru çekin ve rektumu arka tarafından anüse kadar takip etmek için makası kullanın. Rektumu anüste kesin (Şekil 5E).
4. Dokuyu nemli tutmak için dokuyu 1x PBS'ye yerleştirin (Şekil 5I).

5. Serviks-vajina kompleksi hasadı

1. USL'ler serviksten çıkarıldıktan sonra, serviksi tutmak için forsepsleri kullanın. Serviksi makas kullanarak vulvaya mümkün olduğunca yakın kesin (Şekil 5F, G).
   NOT: Vajinanın distal ucunu görsel olarak görmek için kasık simfizini kestiğinizden emin olun.
2. Dokuyu nemli tutmak için dokuyu 1x PBS'ye yerleştirin (Şekil 5J).

Şekil 5: Mesane, rektum ve serviks/vajina diseksiyonları . (A) Mesanenin bir açıyla tutulması. (B) Mesanenin kesilmesi. (C) Serviks ve rektumu birbirine bağlayan tendonun kesilmesi. (D) Tendon 1.0x büyütmede. (E) Rektumun kesilmesi. (F) Forseps ile servikse tutunmak. (G) Vajinanın distal ucunda kesme. (H) 35 mm'lik Petri kabındaki mesane. (I) 35 mm'lik Petri kabındaki rektum. (J) 35 mm'lik Petri kabındaki serviks-vajina doku kompleksi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Doku karakterizasyonu için numune hazırlama

1. USL'nin mekanik ve görsel analizleri
   1. Boyama çözeltisine tam daldırma sağlamak için USL'yi pelvik ataşman ile özel bir boyama kuyusu içinde T şeklinde bir duvarın üzerine yerleştirin (kuyunun CAD çizimleri Ek Kodlama Dosyası 1 ve Ek Kodlama Dosyası 2'de bulunabilir).
      NOT: Yerleştirmeye yardımcı olması için dikiş ve forseps kullanın.
   2. Serbest amin gruplarını (5 μL, Malzeme Tablosuna bakınız) 2,5 mL 1x PBS'de boyayan ticari olarak temin edilebilen bir boyayı seyreltin, çözeltiyi özel boyama kuyusuna ekleyin ve dokuyu 4 ° C'de bir rocker üzerinde 2 saat boyunca lekeleyin.
      NOT: Boyama kuyusuna eklemeden önce çözeltiyi vorteks.
   3. Son 15 dakikalık boyama sırasında, çözeltiye ticari olarak temin edilebilen 2.5 μL ölü hücre çekirdeği boyası ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Boyama kuyucuğuna eklemeden önce çözeltiyi vorteks.
2. USL'lerin Raman analizi
   1. USL'yi, özel bir kuyucukta bulunan bir polidimetilsiloksan (PDMS) bloğu üzerinde düz bir çizgide sabitleyin.
      NOT: PDMS, numunenin istenen konfigürasyonda sabitlenmesini sağlamak için yumuşak bir substrat olarak kullanılır. Farklı boyutlardaki bloklar, üreticinin talimatlarını izleyerek iki bileşenin karıştırılmasıyla (bakınız Malzeme Tablosu), bir Petri kabına dökülerek ve polimerizasyondan sonra PDMS'yi bir neşter bıçağı ile gerekli geometriye keserek yapılabilir.
   2. Dikiş halkasında ve pelvik kasta böcek pimleri ile iğneleyin. Dokuyu 1x PBS ile nemlendirin.
3. Kalan dokular
   1. İstenilen analizlere bağlı olarak, kalan dokuları sıvı azotla veya uygun bir gömme bileşiğinde dondurun.
   2. Sonraki analizlere kadar dokuları -80 ° C'de saklayın (örneğin, immünohistokimyasal veya biyokimyasal tahliller).

Sonuçlar

Vahşi tipte bir farenin diseksiyonunun her adımı, ilişkili videoda ve protokolle ilgili şekillerde ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu çalışmada 6 haftalık dişi C57BL/6J fareler kullanıldı (Ek Tablo 1). Farklı enzimlerle tedavi edilen USL'lere sahip üç örnek grubu analiz edildi: kontrol (tedavi yok), kollajenaz ile tedavi edilen ve kondroitinaz ile tedavi edilen gruplar. USL'deki düz kas, sinirler ve lenfatikler, dokuya mekanik bütünlük sağladığı düşünülen fibriller kol...

Tartışmalar

Yapısal hasarın kadın üreme dokuları üzerindeki etkisi yeterince çalışılmamıştır ve POP araştırması için kolay erişilebilir bir hayvan modeline ihtiyaç vardır. Fare, insan üreme çalışmalarını taklit edebilen uygun maliyetli bir modeldir¹⁶. Kadın üreme sisteminin çalışmasına artan ilgi nedeniyle, bu dokuların çalışmasına yardımcı olacak yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu çalışmada, murin pelvik taban dokularının yapısal ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 Blade	Fisher	3120030	Removable blade
1x PBS	Fisher	BP399-1	Diluted from 10x concentration
Chondroitinase ABC	Sigma	C3667-10UN	Enzyme
Collagenase Type I	Worthington Biochemical	LS004194	Enzyme
Confocal Microscope	Leica	STELLARIS 5	Upright configuration
Dissection Microscope	Leica	S9E	With camera
Dumont #5 Forceps	Fisher	NC9626652	Thin tip
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #: 000664
FemtoTools Micromanipulator	FemtoTools	FT-RS1002	100 mN load cell
FST Curved Forceps	Fisher	NC9639443	Curved tip
FST Sharp 9 mm Scissors	Fisher	NC9639443	Dissection scissors
Ghost Dye 780	Tonbo	13-0865-T500	Free amine stain
Kimwipes	Fisher	06-666	Box of 50 wipes
OCT	Tissue Tek	4583	Used for tissue preservation
PDMS	Thermo Fisher	044764.AK	Follow manufacturer's instructions
Petri Dishes 35 mm	Fisher	FB0875711A	Used for dissected tissue
Polyglactin 5-0 Suture	Veter.Sut	VS385VL	With needle
Renishaw InVia Raman Microscope	Renishaw	PN192(EN)-02-A	With confocal objectives
Rocking Platform	VWR	10127-876	2 tier platform
Surgical Gloves	Fisher	52818	For dissection
Sytox	Thermo Fisher	S11381	Nuclear stain
T-pins	Fisher	S99385	For dissection
Transfer Pipets	Fisher	13-711-7M	For dissection
Underpads	Fisher	22037950	To cover dissection pad