RGBradford：使用智能手机相机进行蛋白质定量

摘要

本文提供了一种使用 Bradford 测定法和智能手机作为分析设备进行蛋白质定量的方案。样品中的蛋白质水平可以使用从智能手机拍摄的微孔板图片中提取的颜色数据进行量化。

摘要

蛋白质定量是生命科学研究中必不可少的程序。在其他几种方法中，布拉德福德测定法是最常用的方法之一。由于其广泛应用，Bradford测定法的局限性和优点已被详尽报道，包括对原始方法的多次修改以提高其性能。原始方法的改变之一是使用智能手机相机作为分析仪器。利用Bradford测定条件下存在的三种形式的考马斯亮蓝染料，本文描述了如何使用从单张微孔板图片中提取的颜色数据准确定量样品中的蛋白质。在微孔板中进行测定后，使用智能手机相机拍摄照片，并使用免费的开源图像分析软件应用程序从图片中提取RGB颜色数据。然后，使用未知蛋白质浓度样品的蓝色与绿色强度之比（在RGB标度中）基于标准曲线计算蛋白质含量。使用RGB颜色数据计算的值与使用常规吸光度数据计算的值之间没有显著差异。

引言

无论下游用途如何（例如 ELISA、酶动力学、蛋白质印迹、蛋白质纯化和质谱），蛋白质定量对于生命科学实验室的准确分析都至关重要。除了用作辅助读数（即计算每质量蛋白质的分析物的相对水平）外，样品中的蛋白质水平本身也可以是所需的输出。例如，人们可能对食物资源¹ 或尿液² 中的蛋白质水平感兴趣。有许多方法可用于测量样品³中的蛋白质浓度，包括直接紫外吸光度读数⁴、蛋白质-铜螯合^5,6、蛋白质-染料结合比色法⁷和蛋白质-染料结合荧光试验⁸。在引用次数最多的^文献9,10的前三名中，有两篇描述蛋白质测量方法^的论文5,7证明了蛋白质定量的相关性。尽管许多作者通过引用非主要参考文献或根本没有引用任何内容而忽略了他们的实际引用，但描述Lowry蛋白测定和Bradford蛋白测定的原始论文各有>200,000次引用

研究方案

1. Bradford蛋白测定试剂的制备

1. 将 100 mg 考马斯亮蓝 G 溶解在 50 mL 95% （w/v） 乙醇中。混合至考马斯亮蓝G完全溶解。
   注意：乙醇易燃，会引起眼睛刺激。避免火焰并使用护目镜。
2. 在前面的溶液中，小心地加入 100 mL 85% （w/v） 磷酸。
   注意： 磷酸对金属有腐蚀性，会导致皮肤腐蚀、严重的眼睛损伤和急性口腔毒性。戴上手套和护目镜。
3. 将含有考马斯亮蓝 G、乙醇和磷酸的溶液缓慢加入 600 mL 去离子水中。
4. 将溶液稀释至最终体积为 1,000 mL。根据要分析的样品数量扩大或缩小规模。如原始方法⁷所述，工作Bradford试剂中的终浓度应为0.01%（w/v）考马斯亮蓝G、4.7%（w/v）乙醇和8.5%（w/v）磷酸。
5. 通过滤纸（Whatman #1 纸或同等纸）去除任何不溶性物质过滤。
6. 该试剂在室温 （RT） 下储存并避光时可稳定数周。必要时过滤，因为沉淀物可能会随着时间的推移而形成。
   注意：或者，市售的即用型 Bradford 试剂也可随手使用。按照制造商的说明制备试剂，然后继续下一步。

2.蛋白质标准溶液的制备

1. 制备分离蛋白质的储备溶液（参见步骤2.....

讨论

本文描述了RGBradford，这是一种使用智能手机摄像头记录来自Bradford蛋白质测定的数据，提取颜色数据并准确定量生物样品中的蛋白质水平的方法，如最近^{最初描述的那样20}。与原始RGBradford方法的一个区别是，这里使用了使用ImageJ插件²² 自动获取颜色数据的过程。RGBradford方法的主要新颖之处在于使用RGB数据作为分析信号;因此，人们可以使用实验室中使用的任何?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.