RGBradford: Количественное определение белка с помощью камеры смартфона

Резюме

В данной статье представлен протокол количественного определения белка с использованием анализа Брэдфорда и смартфона в качестве аналитического устройства. Уровни белка в образцах могут быть количественно определены с помощью цветовых данных, извлеченных из изображения микропланшета, сделанного с помощью смартфона.

Аннотация

Количественное определение белка является важной процедурой в медико-биологических исследованиях. Среди нескольких других методов анализ Брэдфорда является одним из наиболее часто используемых. Из-за его широкого распространения, ограничения и преимущества анализа Брэдфорда были исчерпывающе описаны, включая несколько модификаций оригинального метода для улучшения его характеристик. Одной из переделок оригинального метода является использование камеры смартфона в качестве аналитического инструмента. Используя преимущества трех форм красителя Coomassie Brilliant Blue, которые существуют в условиях анализа Брэдфорда, в этой статье описывается, как точно количественно определить белок в образцах, используя данные о цвете, извлеченные из одного изображения микропланшета. После проведения анализа на микропланшете с помощью камеры смартфона делается снимок, а цветовые данные RGB извлекаются из изображения с помощью бесплатного программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом. Затем отношение интенсивности синего и зеленого (по шкале RGB) образцов с неизвестными концентрациями белка используется для расчета содержания белка на основе стандартной кривой. Существенной разницы между значениями, рассчитанными с использованием цветовых данных RGB, и значениями, рассчитанными с использованием обычных данных поглощения, не наблюдается.

Введение

Независимо от последующего использования (например, ИФА, кинетика ферментов, вестерн-блоттинг, очистка белков и масс-спектрометрия), количественное определение белка имеет решающее значение для точного анализа в лабораториях медико-биологических наук. В дополнение к их использованию в качестве вторичных индикаторов (т.е. для вычисления относительных уровней аналитов на массу белка), уровни белка в образце также могут быть желаемым результатом. Например, можно интересоваться уровнем белка в пищевых ресурсах¹ или в моче². Существует множество методов измерения концентрации белка в образцах³, в том числе прямые показания поглощения УФ-излучения⁴, хелатирование белка и меди ^5,6, колориметрические анализы^{связывания} белка с красителем 7 и флуоресцентные анализы⁸, связывающие белки с красителями. Об актуальности количественного определения белка свидетельствует наличие в топ-3 наиболее цитируемой литературы^двух работ, описывающих методы измерения белка ^{5,7 9,10}. Несмотря на то, что многие авторы пренебрегают фактическим цитированием, ссылаясь на непервичные ссылки или вообще ничего не цитируя, оригинальные статьи, описывающие белковый анализ Лоури и белковый анализ Брэдфорда, насчитывают >200 000 цитирований^каждая.

Популярность теста Брэдфорда обусловлена его доступностью, простотой, скоростью и чувствительностью. Анализ основан на взаимодействии между белками и красителем Coomassie Brilliant Blue G в кислых условиях. В условиях анализа (т.е. при низком рН) краситель существует в трех формах: красная катионная форма с λmax при 470 нм; зеленая нейтральная форма с λmax на длине волны 650 нм; и синяя анионная форма с λmax при 590 нм ^11,12 (рис. 1). Катионная форма преобладает при отсутствии белков. По мере того, как белки взаимодействуют с красителем, они стабилизируют синюю анионную форму, вызывая заметное изменение цвета раствора, от коричневатого до синего. Обычно изменение концентрации синей формы красителя количественно оценивают спектрофотометрически, поглощение которой при 590-595 нм пропорционально количеству белка в анализе.

Рисунок 1: Спектры поглощения G бриллиантового синего цвета Кумасси в условиях Брэдфордского анализа. Три основных пика отмечены стрелками, указывающими λmax красной (470 нм), зеленой (650 нм) и синей (590 нм) форм красителя. Спектры регистрировали в отсутствие белка (желтая линия) и в присутствии 3 мкг (серая линия) и 10 мкг (синяя линия) бычьего сывороточного альбумина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Широкое использование анализа Брэдфорда привело к выявлению ряда ограничений (например, вариабельная реакция на различные белки¹¹ и интерференция липидов¹³ и детергентов⁷) и разработке модификаций для улучшения его характеристик (например, добавление детергентов^14,15, подщелачивание^14,16 и использование коэффициента абсорбции¹⁷). В дополнение к модификациям в самом анализе, также было описано использование альтернативных устройств, таких как смартфоны или камеры, для захвата аналитических сигналов ^18,19,20. Действительно, разработка методов, использующих смартфоны в качестве портативных химических анализаторов, была активной областью исследований. Мотивация использования смартфонов проистекает из доступности, портативности, простоты использования и широкой доступности этих устройств.

В данной работе представлен протокол количественного определения белка с использованием теста RGBradford²⁰, в котором в качестве аналитического устройства используется смартфон. В отличие от оригинальной публикации RGBradford²⁰, здесь была введена процедура, которая упрощает процесс извлечения цвета. Он включает в себя использование свободно доступного программного приложения для автоматического извлечения информации о цвете из каждой лунки изображения на микропластине, что значительно экономит время и усилия. Это альтернатива предыдущему методу ручного получения цветовых данных из каждой скважины по отдельности с помощью графического редактора²⁰. В конечном счете, уровни белка в образцах могут быть количественно определены с помощью цветовых данных, извлеченных из изображения микропланшета, сделанного с помощью смартфона.

протокол

1. Приготовление реагента для белкового анализа Брэдфорда

1. Растворите 100 мг Coomassie Brilliant Blue G в 50 мл 95% (по массе) этанола. Перемешивайте до полного растворения Coomassie Brilliant Blue G.
   ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется и вызывает раздражение глаз. Избегайте пламени и используйте защитные очки.
2. К предыдущему раствору осторожно добавьте 100 мл 85% (по массе) ортофосфорной кислоты.
   ВНИМАНИЕ: Ортофосфорная кислота вызывает коррозию металлов и вызывает коррозию кожи, серьезное повреждение глаз и острую пероральную токсичность. Наденьте перчатки и защитные очки.
3. Медленно добавьте раствор, содержащий Coomassie Brilliant Blue G, этанол и ортофосфорную кислоту, в 600 мл деионизированной воды.
4. Разбавьте раствор до конечного объема 1 000 мл. Увеличение или уменьшение масштаба в зависимости от количества анализируемых образцов. Как описано в оригинальном методе⁷, конечные концентрации в рабочем реактиве Брэдфорда должны составлять 0,01% (масса/об) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (масса/об) этанола и 8,5% (масса/об) фосфорной кислоты.
5. Удалите все нерастворимые материалы, фильтруя фильтровальную бумагу (ватман #1 или эквивалент).
6. Реагент стабилен в течение нескольких недель при хранении при комнатной температуре (RT) и защите от света. При необходимости процеживайте, так как со временем могут образовываться осадки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы в продаже имеются готовые к разбавлению и использованию реагенты Bradford. Следуйте инструкциям производителя по приготовлению реагента и переходите к следующему шагу.

2. Приготовление белковых стандартных растворов

1. Приготовьте исходный раствор (см. шаг 2.4) изолированного белка, который будет использоваться в качестве стандарта. Доступным и широко используемым белком является бычий сывороточный альбумин (БСА). Другими вариантами являются овальбумин и бычий гамма-глобулин.
2. Если известна молярная абсорбционная способность белка, используемого в качестве стандарта, концентрацию исходного раствора проверяют в спектрофотометре.
3. Для BSA обычно используется формула BSA (мг/мл) = (A280/6,6) × 10, где A280 — это поглощение при длине волны 280 нм с длиной пути 1 см, считанное с соответствующим пробелом (т. е._{ε 280}^1% = 6,6)⁷. Например, 0,8 мг/мл БСА имеет абсорбцию 0,528 при 280 нм.
4. Для получения стандартной кривой приготовьте несколько разведений БСА в пределах 0,025 мг/мл и 1,0 мг/мл. Это приведет к получению 0,25-10 мкг БСА на лунку после добавления объема образца 10 мкл на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые стандартные растворы должны быть приготовлены в среде с тем же составом (конечной концентрацией), что и среда, используемая для приготовления образцов.

3. Анализ

1. Разбавляют образцы до достижения концентрации белка в пределах стандартной кривой диапазона 0,025-1,0 мг/мл. Иметь несколько (не менее 3) разведений образца в пределах диапазона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть разбавлены фосфатно-солевым буфером (PBS) или любой другой средой/буферной композицией, совместимой с реагентом Брэдфорда. Конечная концентрация компонентов среды не должна отличаться между стандартными и образцами.
2. Добавьте по 10 мкл каждого стандартного белкового раствора в три лунки (т.е. в трех экземплярах) 96-луночного микропланшета. Для 0 (нулевой) точки белка добавьте 10 мкл буфера/среды, используемой для приготовления стандартных растворов и разведения образцов.
3. К другому набору лунок добавьте по 10 мкл каждого разведения образца в три лунки (т. е. в трех экземплярах) того же 96-луночного микропланшета. Один из подходов заключается в добавлении различных объемов образца и в комплекте со средой до 10 мкл на лунку (например, 0,5 мкл, 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл и 8 мкл образца плюс 9,5 мкл, 9 мкл, 8 мкл, 6 мкл и 2 мкл среды).
4. Добавьте 250 мкл реагента для анализа белка Bradford во все лунки. Типичная схема микропланшета показана на рисунке 2. В этом примере набор пустых лунок, содержащих 260 мкл (окончательный объем на лунку) воды, был включен в качестве заготовки в считыватель микропланшетов (шаг 4.5). Это требуется только в том случае, если также будут собираться данные о поглощении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стандартную кривую в одном и том же микропланшете образцов каждый раз, когда выполняется анализ. Другими словами, если количество образцов требует другой пластины, подготовьте еще одну стандартную кривую во второй пластине и так далее.
5. Запишите результаты (раздел 4) в течение 5-15 минут.

Рисунок 2: Типичная схема планшета для анализа белка в Брэдфорде. Бланк относится к трем лункам, содержащим 260 мкл воды, которые используются в качестве заготовки в считывателе микропланшетов. ЗППП относится к белковым стандартам. S1-S6 представляют собой шесть различных образцов. SX_1-SX_4 представляют собой четыре различных разведения образца для каждого образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

4. Запись результатов

1. В хорошо освещенном помещении держите микропластину параллельно скамье на однородном белом фоне (например, бумажном листе) одной рукой. Обеспечьте точное выравнивание, поместив пузырьковый уровень на пластину.
2. Другой рукой поднесите смартфон параллельно (некоторые приложения камеры полезно указывают на наклон устройства) к скамье и микропланшету и сделайте один или несколько снимков всей микропластины (рисунок 3). На устройствах iOS включите индикатор уровня камеры в настройках камеры, включив опцию «Сетка ». На устройствах Android включите индикатор уровня камеры в настройках камеры, включив подсказки кадрирования.
3. Никаких специальных осветительных приборов не требуется, но будьте осторожны, чтобы избежать теней и отражений. Например, избегайте затенения пластины или фона с помощью смартфона и избегайте затенения фона с помощью микропланшета. Небольшие отражения по краям скважины не являются проблемой; Данные о цвете могут быть извлечены из очень небольшой области в центре каждой скважины.
4. Кратко проверьте изображение на однородность фона, тени и отражения. Кроме того, обратите внимание на угол наклона колодцев; Центр каждого колодца должен быть виден непосредственно (т.е. не за стенками колодца).
5. Если требуется сравнить показания поглощения микропланшета с данными о цвете изображения, считывание микропланшета с длиной волны 590 нм и 450 нм в считывателе²¹ микропланшета.

Рисунок 3: Получение результатов анализа белка в Брэдфорде. В хорошо освещенном помещении микропластину располагают одной рукой параллельно скамье на однородном фоне. Другой рукой смартфон держат параллельно скамье и микропланшету. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Автоматическое извлечение цветовых данных

1. Загрузите ImageJ и ReadPlate²², плагин ImageJ доступен по адресу https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (это файл .txt).
2. Откройте ImageJ, нажмите « Плагины» > «Установить » и выберите файл, загруженный на шаге 6.1.
3. Задайте параметры измерения, нажав « Анализ» > «Установить измерения», и отметьте следующие параметры: Площадь; Стандартное отклонение; Минимальное и максимальное значение серого; Среднее значение серого; Модальное значение серого. В нижней части окна установите Редирект на: Нет и Десятичные знаки (0-9): 3.
4. Перейдите в раздел File > Open (Файл открыть ) и выберите снимок микропластины, сделанный на шаге 4.
5. Перейдите в раздел «Плагины» > ReadPlate. Прочтите инструкции и нажмите кнопку ОК.
6. Выберите количество лунок: 96.
7. С помощью инструмента Прямоугольное выделение, автоматически загружаемого плагином, создайте прямоугольник, начинающийся в центре ячейки A1 и заканчивающийся в центре ячейки H12. Затем нажмите кнопку ОК.
8. Выберите синий канал и нажмите кнопку ОК.
9. Подтвердите параметры по умолчанию, нажав кнопку ОК.
10. Проверьте, очертило ли программное обеспечение область внутри каждой скважины и не покрывают ли выбранные области области с аномальными тенями или отражениями. Нажмите кнопку ОК.
11. Сохраните результаты и повторите шаги 5.8-5.10 для зеленого канала.
12. Рассчитайте соотношение синего и зеленого, используя режим для каждого цвета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет может быть выполнен вручную или с помощью программного обеспечения настроек считывателя, такого как R, Microsoft Excel или GraphPad Prism.

6. Извлечение цветовых данных - Вручную

1. Загрузите Inkscape, бесплатный графический редактор с открытым исходным кодом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение с инструментом палитры цветов (обычно изображается в виде пипетки) может быть использовано для определения цвета и извлечения данных RGB.
2. Откройте Inkscape, перейдите в Файл > Открыть. Выберите снимок микропластины, сделанный на шаге 4.
3. Выберите инструмент «Выделение и трансформация объектов» (S), который изображен в виде стрелки в левом верхнем углу, и нажмите на картинку. Пунктирная линия будет обозначать выбор.
4. Выберите инструмент «Выбрать цвета из изображения» (D), который изображен в виде пипетки с левой стороны.
5. Щелкните в центре колодца. Цвет на нижней панели ("Заливка:") изменится соответствующим образом. Нажмите на цвет, и справа появится вкладка Заливка и обводка .
6. Измените раскрывающееся меню «Однотонный цвет » на RGB. Запишите значения, показанные для синего и зеленого каналов для каждой скважины.
7. Рассчитайте соотношение синего и зеленого, используя записанные значения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет может быть выполнен вручную или с помощью программного обеспечения настроек считывателя, такого как R, Microsoft Excel или GraphPad Prism.

7. Построение стандартных кривых и экстраполяция неизвестных

1. Постройте график среднего отношения интенсивности зеленого к синему в зависимости от стандартной концентрации белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите данные вручную или с помощью программного обеспечения настроек считывателя, такого как R, Microsoft Excel или GraphPad Prism.
2. Рассчитайте среднее отношение интенсивности зеленого к синему для каждого образца и разведения.
3. Проверьте, находится ли сигнал, полученный для образца, в линейном диапазоне белкового стандарта.
4. Игнорируйте любые значения ниже или выше минимальных или максимальных значений стандартной кривой.
5. Используйте линейное уравнение, описывающее стандартную кривую, чтобы экстраполировать количество белка в образце. Соответственно умножьте рассчитанные значения на коэффициент разбавления.

Результаты

На рисунке 4 изображена микропластина, из которой были извлечены цветовые данные, и записано поглощение на длинах волн 450 нм и 590 нм. Данные о цвете RGB, представленные здесь в качестве репрезентативных, были получены автоматически, как описано в разделе 5. Типичным паттерно...

Обсуждение

В этой статье описывается RGBradford, метод, который использует камеру смартфона для записи данных анализа белка в Брэдфорде, извлечения цветовых данных и точного количественного определения уровня белка в биологических образцах, как первоначально было описано^{недавно}. Одно и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.