RGBradford: Proteinquantifizierung mit einer Smartphone-Kamera

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Proteinquantifizierung mit dem Bradford-Assay und einem Smartphone als Analysegerät. Der Proteingehalt in Proben kann anhand von Farbdaten quantifiziert werden, die aus einem mit einem Smartphone aufgenommenen Bild einer Mikrotiterplatte extrahiert werden.

Zusammenfassung

Die Proteinquantifizierung ist ein wesentliches Verfahren in der lebenswissenschaftlichen Forschung. Neben mehreren anderen Methoden ist der Bradford-Assay eine der am häufigsten verwendeten. Aufgrund seiner weiten Verbreitung wurden die Grenzen und Vorteile des Bradford-Assays ausführlich beschrieben, einschließlich mehrerer Modifikationen der ursprünglichen Methode zur Verbesserung seiner Leistung. Eine der Abwandlungen der ursprünglichen Methode ist die Verwendung einer Smartphone-Kamera als Analyseinstrument. Unter Ausnutzung der drei Formen des Coomassie Brilliant Blue-Farbstoffs, die unter den Bedingungen des Bradford-Assays vorliegen, wird in diesem Artikel beschrieben, wie Protein in Proben mithilfe von Farbdaten, die aus einem einzigen Bild einer Mikrotiterplatte extrahiert wurden, genau quantifiziert werden können. Nach der Durchführung des Assays in einer Mikroplatte wird ein Bild mit einer Smartphone-Kamera aufgenommen, und RGB-Farbdaten werden mit einer kostenlosen Open-Source-Bildanalysesoftware aus dem Bild extrahiert. Anschließend wird das Verhältnis von Blau- zu Grünintensität (in der RGB-Skala) von Proben mit unbekannten Proteinkonzentrationen verwendet, um den Proteingehalt auf der Grundlage einer Standardkurve zu berechnen. Es wird kein signifikanter Unterschied zwischen Werten beobachtet, die mit RGB-Farbdaten berechnet wurden, und solchen, die mit herkömmlichen Absorptionsdaten berechnet wurden.

Einleitung

Unabhängig von der nachgelagerten Anwendung (z. B. ELISA, Enzymkinetik, Western Blotting, Proteinreinigung und Massenspektrometrie) ist die Proteinquantifizierung entscheidend für eine genaue Analyse in Life-Sciences-Laboren. Zusätzlich zu ihrer Verwendung als sekundäre Messwerte (d. h. zur Berechnung der relativen Konzentrationen von Analyten pro Proteinmasse) können Proteingehalte in einer Probe auch selbst die gewünschte Ausgabe sein. Zum Beispiel kann man sich für den Proteingehalt in Nahrungsressourcen¹ oder im Urin² interessieren. Es stehen viele Methoden zur Verfügung, um die Proteinkonzentration in Proben

Protokoll

1. Herstellung des Bradford-Protein-Assay-Reagenzes

1. 100 mg Coomassie Brilliant Blue G in 50 ml 95%igem (w/v) Ethanol auflösen. Mixen, bis sich Coomassie Brilliant Blue G vollständig aufgelöst hat.
   VORSICHT: Ethanol ist brennbar und verursacht Augenreizungen. Vermeiden Sie Flammen und verwenden Sie eine Schutzbrille.
2. Zur vorherigen Lösung werden vorsichtig 100 ml 85%ige (w/v) Phosphorsäure zugegeben.
   VORSICHT: Phosphorsäure ist korrosiv gegenüber Metallen und verursacht Hautkorrosion, schwere Augenschäden und akute orale Toxizität. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille.
3. Die Lösung, die Coomassie Brilliant Blue G, Et....

Diskussion

In diesem Artikel wird RGBradford beschrieben, eine Methode, bei der eine Smartphone-Kamera verwendet wird, um Daten aus einem Bradford-Protein-Assay aufzuzeichnen, Farbdaten zu extrahieren und den Proteingehalt in biologischen Proben genau zu quantifizieren, wie ursprünglich kürzlich beschrieben²⁰. Ein Unterschied zum ursprünglichen RGBradford-Verfahren besteht darin, dass hier ein Verfahren zum automatischen Abrufen von Farbdaten mit einem ImageJ-Plugin²² verwendet wur.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.