用于血管生成研究 的改良体内 基质凝胶塞测定

摘要

这里介绍的方法可以在不染色的情况下评估 试剂对体内 血管生成或血管通透性的影响。该方法使用右旋糖酐-FITC通过尾静脉注射来观察新血管或血管渗漏。

摘要

已经开发了几种模型来研究 体内血管生成。然而，这些模型大多复杂且昂贵，需要专门的设备，或者难以进行后续定量分析。在这里，我们提出了一种改良的基质凝胶塞测定法来评估 体内血管生成。在该方案中，在存在或不存在促血管生成或抗血管生成试剂的情况下，将血管细胞与基质凝胶混合，然后皮下注射到受体小鼠的背部。7天后，通过尾静脉注射含有葡聚糖-FITC的磷酸盐缓冲盐水并在血管中循环30分钟。收集基质凝胶塞并用组织包埋凝胶包埋，然后切割 12 μm 切片用于荧光检测，无需染色。在该测定中，高分子量（~150,000 Da）的葡聚糖-FITC可用于指示功能性血管以检测其长度，而低分子量（~4,400 Da）的葡聚糖-FITC可用于指示新血管的渗透性。总之，该方案可为 体内血管生成的定量研究提供一种可靠、方便的方法。

引言

血管生成是从预先存在的血管形成新血管的过程，在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用，例如胚胎发育、伤口愈合、动脉粥样硬化、肿瘤发展等1,2,3,4,5。这种动态过程涉及几个步骤，包括基质的降解、血管细胞增殖、迁移和自组织以形成管状结构以及新血管^{的稳定 6}。促进血管生成已被证明在治疗心肌梗塞、中风和其他类型的缺血性疾病^{中至关重要7}，而抑制血管生成被认为是治疗癌症⁸和类风湿性疾病的有前途的策略⁹。血管生成被认为是药物发现的组织原则¹⁰.因此，构建一种可靠且方便的方法来评估血管生成的程度对于血管生成依赖性疾病的机械研究或药物发现至关重要。

已经开发了几种体外和体内模型来评估血管生成¹¹。其中，二维（2-D）模型，如基质凝胶管形成测定

研究方案

所有涉及动物受试者的程序均已获得温州医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（XMSQ2021-0057,2021 年 7 月 19^日）。所有试剂和耗材都列在 材料表中。

1.培养基制备

1. 10x M199 培养基：将 M199 粉末用 90 mL 去离子水溶解至 10 倍浓度，加入 10 mL 胎牛血清 （FBS），然后通过 0.22 μm 过滤器。将培养基储存在4°C长达2个月。
2. 完全内皮培养基：向 460 mL 内皮细胞培养基 （ECM） 中加入 50 mL FBS、5 mL 青霉素/链霉素和 5 mL 内皮细胞生长补充剂。将培养基储存在4°C长达1个月。

2. 血管细胞制备

1. 在37°C和5%CO₂至70%汇合度的100mm组织培养皿中，用8mL完全内皮培养基培养1×10⁵个血管细胞（原代培养的内皮祖细胞¹⁴，内皮细胞或内皮细胞系）。
2. 取出培养基，用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗培养皿 2 次，以去除未附着的细胞和碎屑。去除PBS并加入3mL含有2.21mM EDTA的0.25%胰蛋白酶，并在....

讨论

我们提出了一种可靠且方便的方法，用于在不染色 的情况下定量评估体内 血管生成。在该方案中，在促血管生成或抗血管生成试剂存在下将血管细胞与基质凝胶混合，然后皮下注射到Nu / Nu小鼠的背部以形成凝胶塞（图1）。凝胶栓形成7天后，静脉注射葡聚糖-FITC循环30分钟。收集凝胶塞并用组织包埋凝胶包埋，并切片 12 μm 用于摄影（图 2）。葡.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF