Ensayo de tapón de gel de matriz in vivo modificado para estudios de angiogénesis

Resumen

El método aquí presentado puede evaluar el efecto de los reactivos sobre la angiogénesis o la permeabilidad vascular in vivo sin tinción. El método utiliza la inyección de dextrano-FITC a través de la vena de la cola para visualizar los neovasos o la fuga vascular.

Resumen

Se han desarrollado varios modelos para investigar la angiogénesis in vivo. Sin embargo, la mayoría de estos modelos son complejos y costosos, requieren equipos especializados o son difíciles de realizar para su posterior análisis cuantitativo. En este trabajo se presenta un ensayo de tapón de gel de matriz modificada para evaluar la angiogénesis in vivo. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia o ausencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la espalda de los ratones receptores. Después de 7 días, se inyecta solución salina tampón fosfato que contiene dextrano-FITC a través de la vena de la cola y se hace circular en los vasos durante 30 min. Los tapones de gel de matriz se recogen y se incrustan con gel de inclusión de tejido, luego se cortan secciones de 12 μm para la detección de fluorescencia sin tinción. En este ensayo, el dextrano-FITC con alto peso molecular (~150.000 Da) se puede utilizar para indicar los vasos funcionales para detectar su longitud, mientras que el dextrano-FITC con bajo peso molecular (~4.400 Da) se puede utilizar para indicar la permeabilidad de los neovasos. En conclusión, este protocolo puede proporcionar un método fiable y conveniente para el estudio cuantitativo de la angiogénesis in vivo.

Introducción

La angiogénesis, el proceso de formación de neovasos a partir de vasos preexistentes, desempeña un papel fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos, como el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, el desarrollo tumoral, etc.1,2,3,4,5. Este proceso dinámico involucra varias etapas, incluyendo la degradación de la matriz, la proliferación de células vasculares, la migración y autoorganización para formar estructuras tubulares y la estabilización de los neovasos

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Médica de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19 de julio de 2021). Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación del medio de cultivo

1. Medio de cultivo 10x M199: Disolver el polvo de M199 a una concentración de 10x con 90 mL de agua desionizada y agregar 10 mL de suero fetal bovino (FBS), luego pasar a través de un filtro de 0,22 μm. Conservar el medio a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
2. Medio de cul....

Discusión

Presentamos un método fiable y conveniente para la evaluación cuantitativa de la angiogénesis in vivo sin tinción. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la parte posterior de los ratones Nu/Nu para formar un tapón de gel (Figura 1). Después de 7 días de formación del tapón de gel, se inyectó dextran-FITC por vía intravenosa y se.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF