Ensayo de tapón de gel de matriz in vivo modificado para estudios de angiogénesis

Resumen

El método aquí presentado puede evaluar el efecto de los reactivos sobre la angiogénesis o la permeabilidad vascular in vivo sin tinción. El método utiliza la inyección de dextrano-FITC a través de la vena de la cola para visualizar los neovasos o la fuga vascular.

Resumen

Se han desarrollado varios modelos para investigar la angiogénesis in vivo. Sin embargo, la mayoría de estos modelos son complejos y costosos, requieren equipos especializados o son difíciles de realizar para su posterior análisis cuantitativo. En este trabajo se presenta un ensayo de tapón de gel de matriz modificada para evaluar la angiogénesis in vivo. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia o ausencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la espalda de los ratones receptores. Después de 7 días, se inyecta solución salina tampón fosfato que contiene dextrano-FITC a través de la vena de la cola y se hace circular en los vasos durante 30 min. Los tapones de gel de matriz se recogen y se incrustan con gel de inclusión de tejido, luego se cortan secciones de 12 μm para la detección de fluorescencia sin tinción. En este ensayo, el dextrano-FITC con alto peso molecular (~150.000 Da) se puede utilizar para indicar los vasos funcionales para detectar su longitud, mientras que el dextrano-FITC con bajo peso molecular (~4.400 Da) se puede utilizar para indicar la permeabilidad de los neovasos. En conclusión, este protocolo puede proporcionar un método fiable y conveniente para el estudio cuantitativo de la angiogénesis in vivo.

Introducción

La angiogénesis, el proceso de formación de neovasos a partir de vasos preexistentes, desempeña un papel fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos, como el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, el desarrollo tumoral, etc.1,2,3,4,5. Este proceso dinámico involucra varias etapas, incluyendo la degradación de la matriz, la proliferación de células vasculares, la migración y autoorganización para formar estructuras tubulares y la estabilización de los neovasos⁶. Se ha demostrado que la promoción de la angiogénesis es fundamental en el tratamiento del infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular y otros tipos de enfermedades isquémicas⁷, mientras que la inhibición de la angiogénesis se ha considerado una estrategia prometedora en el tratamiento de cánceres⁸ y enfermedades reumatoides9. La angiogénesis ha sido considerada como un principio organizador para el descubrimiento de fármacos¹⁰. Por lo tanto, la construcción de un método confiable y conveniente para evaluar el alcance de la angiogénesis es fundamental para la investigación mecánica o el descubrimiento de fármacos en enfermedades dependientes de angiogénesis.

Se han desarrollado varios modelos in vitro e in vivo para evaluar la angiogénesis¹¹. Entre estos, los modelos bidimensionales (2-D), como el ensayo de formación de tubos de gel^{de matriz 12}, no pueden formar estructuras tubulares funcionales. Los modelos animales, como el modelo de isquemia de las extremidades posteriores^13,14, pueden reproducir el proceso de angiogénesis, pero son complejos y requieren un sistema de imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser. Los modelos 3D de morfogénesis vascular, como el ensayo de tapón de gel de matriz, proporcionan una plataforma simple que puede imitar el proceso de angiogénesis in vivo¹⁵, pero la detección de angiogénesis requiere inmunohistoquímica o tinción de inmunofluorescencia 16,17,18, que son variables y poco visualizadas.

Aquí, describimos un protocolo para un ensayo de tapón de gel de matriz modificada en el que las células vasculares se mezclaron con gel de matriz y se inyectaron subcutáneamente en la parte posterior de ratones para formar un tapón. En el tapón, las células vasculares necesitan degradar la matriz, proliferar, migrar y autoorganizarse para finalmente formar vasos funcionales con flujo sanguíneo en el entorno interno. A partir de entonces, se inyecta dextrano marcado con fluorescencia a través de la vena de la cola, para fluir a través del tapón, y la etiqueta se visualiza para indicar neovasos. El contenido de angiogénesis puede evaluarse cuantitativamente por la longitud de los vasos. Este método puede formar vasos funcionales que no se pueden producir en modelos de angiogénesis 2D¹², y no necesita un proceso de tinción complejo como en el ensayo de tapón de gel de matriz ordinario¹¹. Tampoco requiere instrumentos específicos costosos como el sistema de imágenes de flujo sanguíneo moteado con láser en la isquemia de las extremidades posteriores modelo 13,14,19. Este método es versátil, de bajo costo, cuantificable y fácil de realizar, y puede utilizarse para determinar la capacidad proangiogénica o antiangiogénica de los fármacos o utilizarse en la investigación mecánica implicada en la angiogénesis.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Médica de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19 de julio de 2021). Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación del medio de cultivo

1. Medio de cultivo 10x M199: Disolver el polvo de M199 a una concentración de 10x con 90 mL de agua desionizada y agregar 10 mL de suero fetal bovino (FBS), luego pasar a través de un filtro de 0,22 μm. Conservar el medio a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
2. Medio de cultivo endotelial completo: Agregue 50 ml de FBS, 5 ml de penicilina/estreptomicina y 5 ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales a 460 ml de medio de células endoteliales (MEC). Almacene el medio a 4 °C durante un máximo de 1 mes.

2. Preparación de células vasculares

1. Cultivo de 1 x 10⁵ células vasculares (células progenitoras endoteliales¹⁴ cultivadas primarias, células endoteliales o líneas celulares endoteliales) con 8 mL de medio de cultivo endotelial completo en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm a 37 °C y 5% de CO₂ a 70% de confluencia.
2. Retire el medio de cultivo y enjuague la placa 2 veces con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células sueltas y los desechos. Retirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina al 0,25% que contenga 2,21 mM de EDTA, e incubar a 37 °C durante 1 min.
3. Neutralice la tripsina con 7 ml de medio de cultivo endotelial completo y enjuague suavemente las células de la placa de cultivo. Confirme el desprendimiento de células bajo un microscopio óptico (aumento de 40x).
4. Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 ml y centrifugue a 400 x g durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células con 5 mL de medio de cultivo endotelial completo.
5. Cuente las células con un hemocitómetro y mueva la suspensión que contiene 2 x 10⁶ células a un tubo estéril de 1,5 ml. Cada enchufe contiene 1,5 x 10⁶ celdas, se utiliza un 25% adicional de celdas en caso de desperdicio. Cada grupo incluye al menos 3 enchufes.
   NOTA: Después de los ensayos, se encontró que 1,5 x 10⁶ células en 300 μL de gel de matriz condujeron al desarrollo adecuado de la angiogénesis y, por lo tanto, se eligió para la experimentación.
6. Centrifugar la suspensión celular a 400 x g durante 5 min a las celdas de gránulos y luego eliminar el sobrenadante.

3. Preparación del gel de matriz

1. Enfriar previamente tubos estériles de 1,5 ml que contienen gránulos celulares en un baño de agua a 4 °C. Enfríe previamente jeringas de insulina de 30 G y 1 ml en un refrigerador a 4 °C.
2. Descongelar completamente el gel de matriz en un baño de agua a 4 °C. No mezcle ni haga vórtices. Enfriar previamente 10x M199 y probar el reactivo/fármaco de interés en un baño de agua a 4 °C.
3. Mezcle el gel de matriz preenfriado con 10x M199 que contenga un 10 % de FBS y el reactivo que se va a probar a una relación de volumen de 8,8:1:0,2 para obtener una mezcla de gel de matriz y M199 que contenga un 1 % de FBS y el reactivo.
4. Resuspender las células con 400 μL de la mezcla de gel de matriz, mezclar suavemente para evitar la formación de burbujas. Mantenga el tubo en hielo hasta que los ratones estén preparados para la inyección. Mantenga la mezcla de gel de matriz en hielo todo el tiempo para evitar la coagulación.
   NOTA: Aquí, se utilizaron 300 μL de mezcla de gel de matriz que contenía 1,5 x 10⁶ células para formar el tapón de gel. Prepare un 25% de gel adicional de acuerdo con un 25% de células adicionales en el paso 2.

4. Preparación del ratón

1. Anestesiar ratones machos Nu/Nu de 6-8 semanas de edad (18-25 g) en la cámara del dispositivo de anestesia animal con isoflurano (isoflurano al 3% en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min). Después de una anestesia exitosa, confirmada por la ausencia de reflejo de enderezamiento y reflejo de pellizco de los dedos de los pies, saque el ratón de la cámara, coloque una máscara de anestesia en el ratón y cambie la concentración de isoflurano al 1,5% en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min.
   NOTA: Proporcione soporte térmico al animal utilizando una almohadilla térmica durante todo el procedimiento.
2. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad. Pegue con cinta adhesiva las extremidades de los ratones en la placa de operaciones en posición prona.

5. Inyección de mezcla de gel de matriz

1. Cargue 300 μL de la mezcla de gel de matriz en una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja de 30G. Evite la formación de burbujas. Cargue rápidamente el gel de matriz (dentro de los 2 minutos) para evitar la solidificación durante este tiempo. Coloque la jeringa de insulina cargada con gel de matriz sobre hielo inmediatamente.
2. Limpie la piel de la espalda de los ratones con almohadillas con alcohol al 75%. Por vía subcutánea, inyecte 300 μL de mezcla de gel de matriz en un lado de la espalda de los ratones.
3. Retire suavemente la aguja del lugar de la inyección para evitar fugas de la mezcla de gel de matriz. Compruebe si hay una pequeña joroba en el lugar de la inyección (Figura 1).
4. Coloque el mouse en la almohadilla térmica durante 2 minutos para que la mezcla de gel de matriz se coagule y forme un tapón.
5. Repita los pasos 5.2. a 5.4. para crear un enchufe en el otro lado de la parte posterior del mouse. Marca los bordes de las jorobas con un rotulador.
6. Observe al ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Coloque al ratón en una jaula separada hasta que se recupere por completo. Alojar a los ratones en un laboratorio de animales de experimentación de clase SPF a 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h durante 7 días.

6. Inyección de Dextran-FITC a través de la vena de la cola

1. Después de 7 días de inyección de gel de matriz, resuspender 0,5 mg de dextrano-FITC con 500 μL de agua bidestilada (ddH₂O) y luego vórtice violentamente para obtener la solución de dextrano-FITC a la concentración final de 1 μg/μL.
   NOTA: Use dextran-FITC con un peso molecular de ~ 150 kDa para el ensayo de angiogénesis y use dextran-FITC con un peso molecular de ~ 4 kDa para el ensayo de permeabilidad vascular.
2. Cargue 50 μL de solución de dextrano-FITC en las jeringas de 29G.
3. Fije el mouse en el instrumento de inyección de la vena de la cola. Limpie la cola con una bola de algodón con alcohol al 75% e inyecte suavemente 50 μL de dextrano-FITC a través de la vena de la cola.
4. Comprima el lugar de la inyección con un hisopo de algodón durante 1 minuto para detener el sangrado y luego vuelva a colocar a los ratones en la jaula durante 30 minutos.
5. Repita los pasos 6.3. y 6.4. hasta que todos los ratones hayan recibido la inyección de dextran-FITC.

7. Colección de tapones de gel Matrix

1. Inyectar por vía intraperitoneal 1% de pentobarbital sódico en PBS (200 mg/kg de peso corporal) y sacrificar a los ratones con un procedimiento aprobado por la IACUC.
2. Corte la piel a lo largo del borde marcado del tapón con unas tijeras quirúrgicas y retire la piel por encima del tapón de gel de matriz.
3. Recoja el tapón y enjuáguelo en un vaso de precipitados pequeño con 1x PBS para eliminar el exceso de sangre (Figura 2A). El color del tapón puede delinear aproximadamente el grado de abundancia de sangre y el contenido de neovasos (Figura 3A).

8. Incrustación del tapón de gel de matriz y preparación de la sección

1. Cubra el botón del casete de inclusión de tejido con aproximadamente 0,5 ml de gel de inclusión de tejido, luego coloque inmediatamente el tapón de gel de matriz sobre el gel de inclusión de tejido en la orientación deseada como se muestra en la Figura 2B. A continuación, incruste el tapón con gel de inclusión de tejido adicional.
2. Coloque los casetes en un congelador a -80 °C durante 12 h para que se solidifiquen.
3. Para la preparación de secciones gruesas, saque el bloque de tapón solidificado y corte secciones de 12 μm de espesor con el micrótomo de congelación de acuerdo con las instrucciones, y móntelo en portaobjetos de microscopio.
4. Corta de 5 a 10 secciones de cada bloque de enchufe.

9. Cuantificación de la angiogénesis (Figura 3)

1. Adquiera imágenes de fluorescencia de 5 campos independientes de la sección con un microscopio de fluorescencia invertida a una longitud de onda de 488 nm con un aumento de 10x.
2. Abra el archivo de imagen con el software Image J (https://imagej.en.softonic.com/) y haga clic en el botón Analizar angiogénesis . A continuación, haga clic en el botón Analizar contraste de fase HUVEC y cambie a Tabla de resultados estadísticos para recopilar información. Mida las 5 imágenes de fluorescencia adquiridas para cada sección.
3. Analizar la longitud total de los neovasos de diferentes grupos para evaluar estadísticamente la diferencia en la angiogénesis entre estos grupos.
   NOTA: La longitud total de los segmentos maestros indica la longitud total de los neobuques. El reactivo que aumenta la longitud de los neovasos se denomina proangiogénico, mientras que el reactivo que disminuye la longitud de los neovasos es antiangiogénico.

10. Cuantificación de la permeabilidad vascular (Figura 4)

1. Adquiera imágenes de fluorescencia de 5 campos independientes de la sección con un microscopio de fluorescencia invertida a una longitud de onda de 488 nm con un aumento de 20x.
2. Abra el archivo de imagen con el software Image J. Haga clic en el botón Selección a mano alzada y encierre en un círculo el área de fuga, luego haga clic en el menú Analizar y seleccione la opción Medir para obtener la información del área del área de fuga. Utilice la relación entre el área de fuga y el área de la imagen para indicar la permeabilidad vascular.
3. Analizar la relación entre el área de fuga y el área de la imagen de diferentes grupos para evaluar estadísticamente la diferencia en la permeabilidad vascular entre estos grupos.

Resultados

La Figura 1 es el diagrama de flujo que muestra cómo preparar la mezcla de gel de matriz, células vasculares, medio de cultivo y reactivo. A continuación, la mezcla se inyectó por vía subcutánea en la espalda de ratones Nu/Nu y se calentó con una almohadilla térmica para acelerar su coagulación y finalmente formar un tapón de gel.

La Figura 2A es el diagrama de flujo para indicar los vasos con dextrano marcado con fluorescen...

Discusión

Presentamos un método fiable y conveniente para la evaluación cuantitativa de la angiogénesis in vivo sin tinción. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la parte posterior de los ratones Nu/Nu para formar un tapón de gel (Figura 1). Después de 7 días de formación del tapón de gel, se inyectó dextran-FITC por vía intravenosa y se...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF