血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ

要約

ここで紹介する方法は、in vivo で血管新生または血管透過性に対する試薬の効果を染色なしで評価できます。この方法では、尾静脈からデキストランFITC注射を使用して、血管新生または血管漏出を視覚化します。

要約

in vivoでの血管新生を調べるために、いくつかのモデルが開発されています。しかし、これらのモデルのほとんどは複雑で高価であり、特殊な機器を必要としたり、その後の定量分析のために実行したりするのが困難です。ここでは、in vivoでの血管新生を評価するための修飾マトリックスゲルプラグアッセイを紹介します。このプロトコルでは、血管細胞は、血管新生促進剤または血管新生防止試薬の存在下または非本位でマトリックスゲルと混合され、次にレシピエントマウスの背部に皮下注射されました。7日後、デキストラン-FITCを含むリン酸緩衝生理食塩水を尾静脈から注入し、血管内を30分間循環させる。マトリックスゲルプラグを回収し、組織包埋ゲルで包埋した後、12 μm切片を切断して染色せずに蛍光検出を行います。このアッセイでは、高分子量(~150,000 Da)のデキストラン-FITCを使用して機能性血管の長さを示し、低分子量(~4,400 Da)のデキストラン-FITCを使用して新血管の透過性を示すことができます。結論として、このプロトコルは生体内の血管新生の量的な調査に信頼できる、便利な方法を提供できる。

概要

血管新生は、既存の血管から新血管を形成するプロセスであり、胚発生、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍発生など、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします^1,2,3,4,5。このダイナミックなプロセスには、マトリックスの分解、血管細胞の増殖、管状構造を形成するための移動と自己組織化、および新血管の安定化など、いくつかのステップ^{が含まれます6。}血管新生の促進は、心筋梗塞、脳卒中、その他の虚血性疾患の治療において重要であることが実証されており⁷、血管新生の阻害は、がん⁸やリウマチ性疾患⁹の治療において有望な戦略と考えられています。血管新生は創薬の組織化原理と考えられてきた¹⁰。したがって、血管新生の程度を評価するための信頼性が高く便利な方法の構築は、血管新生依存性疾患における機械的研究または創薬にとって重要です。

血管新生を評価するために、いくつかのin vitroおよびin vivoモデルが開発されている¹¹。これらのうち、マトリックスゲルチューブ形成アッセイ¹²のような2次元(2D)モデルは、機能的な管状構造を形成することができない。後肢虚血モデル^13,14などの動物モデルは、血管新生過程を再現することができるが、複雑であり、レーザースペックル血流イメージングシステムを必要とする。マトリックスゲルプラグアッセイのような血管形態形成の3Dモデルは、in vivoでの血管新生のプロセスを模倣できるシンプルなプラットフォームを提供する¹⁵が、血管新生の検出には免疫組織化学または免疫蛍光染色16,17,18が必要であり、これらはばらつきがあり、視覚化が不十分である。

ここでは、血管細胞をマトリックスゲルと混合し、マウスの背中に皮下注射してプラグを形成する改変マトリックスゲルプラグアッセイのプロトコルについて説明します。プラグでは、血管細胞がマトリックスを分解し、増殖し、移動し、自己組織化して、最終的に内部環境で血流のある機能的な血管を形成する必要があります。その後、蛍光標識デキストランを尾静脈から注入してプラグ内を流れ、標識を可視化して血管新生を示します。血管新生の内容は、血管の長さによって定量的に評価することができる。この方法は、2次元血管新生モデル¹²では作製できない機能性血管を形成することができ、通常のマトリックスゲルプラグアッセイ¹¹のような複雑な染色プロセスを必要としない。また、後肢虚血モデル^13,14,19のレーザースペックル血流イメージングシステムのような高価な特定の機器を必要としません。この方法は、汎用性が高く、低コストで、定量化可能で、実行が容易であり、薬物の血管新生促進能力または抗血管新生能力を決定するために使用したり、血管新生に関与する機械的研究に使用したりできます。

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、温州医科大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました(XMSQ2021-0057、2021年7月19^日)。すべての試薬と消耗品は、 材料表に記載されています。

1. 培地の調製

1. 10x M199 培地:M199 粉末を 90 mL の脱イオン水で 10 倍の濃度に溶解し、10 mL のウシ胎児血清(FBS)を加え、0.22 μm フィルターに通します。培地を4°Cで最大2か月間保存します。
2. 完全内皮培養培地:460 mLの内皮細胞培地(ECM)に、FBS50 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン5 mL、および内皮細胞増殖サプリメント5 mLを加えます。培地を4°Cで最大1か月間保存します。

2. 血管細胞の調製

1. 1 x 10⁵ 血管細胞 (初代培養内皮前駆細胞¹⁴、内皮細胞、または内皮細胞株) を 8 mL の完全な内皮培養培地で 100 mm 組織培養皿に入れ、37 °C および 5% CO₂ 〜 70% の濃度で培養します。
2. 培地を取り出し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で皿を2回すすぎ、付着していない細胞や破片を取り除きます。PBSを除去し、2.21 mM EDTAを含む0.25%トリプシン3 mLを加え、37°Cで1分間インキュベートします。
3. 7 mLの完全内皮培養培地でトリプシンを中和し、培養皿から細胞を静かに洗い流します。光学顕微鏡(倍率40倍)で細胞剥離を確認します。
4. 細胞懸濁液を15 mLチューブに回収し、400 x g で10分間遠心分離します。上清を除去し、5 mLの完全内皮培養培地で細胞を再懸濁します。
5. 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、2 x 10⁶ 細胞を含む懸濁液を滅菌1.5 mLチューブに移します。各プラグには1.5 x 10⁶ セルが含まれており、廃棄物の場合は追加の25%セルが使用されます。各グループには、少なくとも 3 つのプラグが含まれています。
   注:試験の結果、300 μLのマトリックスゲル中の1.5 x 10⁶ 細胞が血管新生の適切な発達につながることがわかったため、実験に選択しました。
6. 細胞懸濁液を400 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去します。

3. マトリックスゲルの調製

1. 細胞ペレットを含む滅菌済み 1.5 mL チューブを 4 °C のウォーターバスで予冷します。30G 1 mLのインスリンシリンシリンジを4°Cの冷蔵庫で予冷します。
2. マトリックスゲルを4°Cのウォーターバスで完全に解凍します。混ぜたり、渦巻いたりしないでください。10x M199 を予冷し、試薬/目的薬物を 4 °C のウォーターバスで試験します。
3. 予冷したマトリックスゲルを、10% FBSを含む10x M199と試験する試薬を体積比8.8:1:0.2で混合し、1% FBSと試薬を含むマトリックスゲルとM199混合物を得ます。
4. 細胞を400 μLのマトリックスゲル混合物で再懸濁し、気泡が形成されないように穏やかに混合します。マウスが注射の準備が整うまで、チューブを氷上に置いておきます。凝固を避けるために、マトリックスゲル混合物を常に氷上に保管してください。
   注:ここでは、1.5 x 10⁶ 細胞を含む300 μLのマトリックスゲル混合物を使用して、ゲルプラグを形成しました。ステップ2で25%の追加細胞に従って、25%の追加ゲルを調製します。

4. マウスの準備

1. 6〜8週齢の雄のNu / Nuマウス(18〜25 g)を動物麻酔装置のチャンバーでイソフルラン(100%酸素中の3%イソフルラン、1 L / minの流量)で麻酔します。.麻酔が成功した後、正立反射とつま先挟み反射がないことを確認した後、マウスをチャンバーの外に移動させ、マウスをチャンバーから移動させ、マウスに麻酔マスクを装着し、イソフルランの濃度を100%酸素中で1.5%に1L / minの流量で変更します。
   注意: 手順全体を通して、温熱パッドを使用して動物に熱サポートを提供します。
2. 乾燥を防ぐために、目に獣医の軟膏を使用してください。マウスの手足を操作ボードにうつ伏せの位置にテープで固定します。

5. マトリックスゲル混合物注入

1. 300 μL のマトリックスゲル混合物を 30G 針で 1 mL のインスリンシリンジにロードします。気泡の形成を避けてください。マトリックスゲルをすばやく(2分以内に)ロードして、この間の凝固を防ぎます。マトリックスゲルを装填したインスリン注射器をすぐに氷の上に置きます。
2. マウスの背中の皮膚を75%アルコールパッドできれいにします。300μLのマトリックスゲル混合物をマウスの背中の片側に皮下注射します。
3. マトリックスゲル混合物の漏れを防ぐために、注射部位から針をそっと取り外します。注射部位に小さなこぶがないか確認します(図1)。
4. マウスを加熱パッドの上に2分間置き、マトリックスゲル混合物を凝固させてプラグを形成します。
5. 手順 5.2 を繰り返します。を 5.4 に変更。マウスの背面の反対側にプラグを作成します。マーカーペンを使用してこぶの端に印を付けます。
6. マウスが胸骨臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで観察します。マウスが完全に回復するまで、マウスを別のケージに入れます。22±2°CのSPFクラスの実験動物実験室で、12時間の明暗サイクルで7日間マウスを飼育します。

6.尾静脈からのデキストラン-FITC注射

1. マトリックスゲル注入の7後、0.5mgのデキストラン-FITCを500μLの二重蒸留水(ddH2O)で再懸濁し、次いで激しくボルテックスして、最終濃度1μg/μLのデキストラン-FITC溶液を得る。
   注:血管新生アッセイには分子量~150 kDaのデキストラン-FITCを使用し、血管透過性アッセイには分子量~4 kDaのデキストラン-FITCを使用してください。
2. 50 μLのデキストラン-FITC溶液を29Gシリンジにロードします。
3. 尾静脈注射器具にマウスを固定します。75%アルコールコットンボールでテールを洗浄し、尾静脈から50μLのデキストラン-FITCを静かに注入します。
4. 注射部位を綿棒で1分間圧迫して出血を止めた後、マウスをケージに30分間戻します。
5. 手順 6.3 を繰り返します。および6.4。すべてのマウスがデキストラン-FITC注射を受けるまで。

7. マトリックスのゲルのプラグのコレクション

1. PBS(200 mg / kg体重)に1%ペントバルビタールナトリウムを腹腔内に注射し、IACUC承認の手順でマウスを安楽死させます。
2. 外科用ハサミを使用してプラグのマークされた境界に沿って皮膚を切断し、マトリックスゲルプラグの上の皮膚を取り除きます。
3. プラグを回収し、1x PBSを含む小さなビーカーですすぎ、余分な血液を洗い流します(図2A)。プラグの色は、血液の豊富さと新生血管の内容物を大まかに表すことができます(図3A)。

8. 包埋マトリックスゲルプラグと切片の準備

1. 組織包埋カセットのボタンを約0.5 mLの組織包埋ゲルで覆い、すぐにマトリックスゲルプラグを図 2Bに示すように、組織包埋ゲルに目的の向きで配置します。次に、追加の組織包埋ゲルでプラグを埋め込みます。
2. カセットを-80°Cの冷凍庫に12時間入れて固化させます。
3. 厚切片の作製は、固化したプラグブロックを取り出し、指示に従って凍結ミクロトームを用いて厚さ12μmの切片を切断し、顕微鏡スライドにマウントします。
4. 各プラグブロックから5〜10セクションをスライスします。

9. 血管新生の定量化(図3)

1. 切片の5つの独立した視野から、波長488nm、倍率10倍の倒立蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得します。
2. Image Jソフトウェア(https://imagej.en.softonic.com/)で画像ファイルを開き、 Angiogenesis Analyze ボタンをクリックします。次に、 Analyze HUVEC Phase Contrast ボタンをクリックし、 Stat Results Table に切り替えて情報を収集します。各切片について取得した5枚の蛍光画像をすべて測定します。
3. 異なるグループの新血管の全長を分析して、これらのグループ間の血管新生の違いを統計的に評価します。
   注:マスターセグメントの総長は、ネオベッセルの全長を示します。新血管の長さを長くする試薬は血管新生促進剤と呼ばれ、新血管の長さを短くする試薬は抗血管新生と呼ばれます。

10. 血管透過性の定量化(図4)

1. 切片の5つの独立したフィールドから、波長488nm、倍率20倍の倒立蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得します。
2. Image J ソフトウェアで画像ファイルを開きます。 [フリーハンド選択 ]ボタンをクリックして漏水領域を丸で囲み、[ 分析 ]メニューをクリックして[ 測定 ]オプションを選択し、漏水領域の領域情報を取得します。漏れ面積と画像面積の比率を使用して、血管透過性を示します。
3. 異なるグループからの漏れ面積と画像面積の比率を分析し、これらのグループ間の血管透過性の違いを統計的に評価します。

結果

図1 は、マトリックスゲル、血管細胞、培地および試薬の混合物を調製する方法を示すフローチャートである。次に、混合物をNu/Nuマウスの背中に皮下注射し、加熱パッドを使用して加熱し、凝固を促進して最終的にゲルプラグを形成しました。

図2A は、蛍光標識デキストランを有する血管を示すためのフローチャートである?...

ディスカッション

染色せずに in vivo での血管新生を定量的に評価するための信頼性が高く簡便な方法を紹介します。このプロトコルでは、血管細胞を血管新生促進剤または抗血管新生試薬の存在下でマトリックスゲルと混合し、Nu/Nuマウスの背中に皮下注射してゲルプラグを形成しました(図1)。ゲルプラグ形成の7日後、デキストラン-FITCを静脈内注射し、30分間循環させた。ゲルプ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF