血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ

要約

ここで紹介する方法は、in vivo で血管新生または血管透過性に対する試薬の効果を染色なしで評価できます。この方法では、尾静脈からデキストランFITC注射を使用して、血管新生または血管漏出を視覚化します。

要約

in vivoでの血管新生を調べるために、いくつかのモデルが開発されています。しかし、これらのモデルのほとんどは複雑で高価であり、特殊な機器を必要としたり、その後の定量分析のために実行したりするのが困難です。ここでは、in vivoでの血管新生を評価するための修飾マトリックスゲルプラグアッセイを紹介します。このプロトコルでは、血管細胞は、血管新生促進剤または血管新生防止試薬の存在下または非本位でマトリックスゲルと混合され、次にレシピエントマウスの背部に皮下注射されました。7日後、デキストラン-FITCを含むリン酸緩衝生理食塩水を尾静脈から注入し、血管内を30分間循環させる。マトリックスゲルプラグを回収し、組織包埋ゲルで包埋した後、12 μm切片を切断して染色せずに蛍光検出を行います。このアッセイでは、高分子量(~150,000 Da)のデキストラン-FITCを使用して機能性血管の長さを示し、低分子量(~4,400 Da)のデキストラン-FITCを使用して新血管の透過性を示すことができます。結論として、このプロトコルは生体内の血管新生の量的な調査に信頼できる、便利な方法を提供できる。

概要

血管新生は、既存の血管から新血管を形成するプロセスであり、胚発生、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍発生など、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします^1,2,3,4,5。このダイナミックなプロセスには、マトリックスの分解、血管細胞の増殖、管状構造を形成するための移動と自己組織化、および新血管の安定化など、いくつかのステップ^{が含まれます6。}血管新生の促進は、心筋梗塞、脳卒中、その他の虚血性疾患の治療において重要であることが実証されており⁷、血管新生の阻害は、がん⁸やリウマチ性疾患⁹の治療において有望な戦略と考えられています。血管新生は創薬の組織化原理と考えられてきた¹⁰。したがって、血管新生の程度を評価するための信頼性が高く便利な方法の構築は、血管新生依存性疾患における機械的研究または創薬にとって重要です。

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、温州医科大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました(XMSQ2021-0057、2021年7月19^日)。すべての試薬と消耗品は、 材料表に記載されています。

1. 培地の調製

1. 10x M199 培地:M199 粉末を 90 mL の脱イオン水で 10 倍の濃度に溶解し、10 mL のウシ胎児血清(FBS)を加え、0.22 μm フィルターに通します。培地を4°Cで最大2か月間保存します。
2. 完全内皮培養培地:460 mLの内皮細胞培地(ECM)に、FBS50 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン5 mL、および内皮細胞増殖サプリメント5 mLを加えます。培地を4°Cで最大1か月間保存します。

2. 血管細胞の調製

1. 1 x 10⁵ 血管細胞 (初代培養内皮前駆細胞¹⁴、内皮細胞、または内皮細胞株) を 8 mL の完全な内皮培養培地で 100 mm 組織培養皿に入れ、37 °C および 5% CO₂ 〜 70% の濃度で培養します。
2. 培地を取り出し、1xリン酸緩衝....

ディスカッション

染色せずに in vivo での血管新生を定量的に評価するための信頼性が高く簡便な方法を紹介します。このプロトコルでは、血管細胞を血管新生促進剤または抗血管新生試薬の存在下でマトリックスゲルと混合し、Nu/Nuマウスの背中に皮下注射してゲルプラグを形成しました(図1)。ゲルプラグ形成の7日後、デキストラン-FITCを静脈内注射し、30分間循環させた。ゲルプ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF