Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

Resumo

O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

Resumo

Vários modelos têm sido desenvolvidos para investigar a angiogênese in vivo. No entanto, a maioria desses modelos é complexa e cara, requer equipamentos especializados ou é de difícil execução para posterior análise quantitativa. Apresentamos aqui um ensaio de plugue de gel de matriz modificado para avaliar a angiogênese in vivo. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença ou ausência de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso dos camundongos receptores. Após 7 dias, tampão fosfato salino contendo dextran-FITC é injetado através da veia caudal e circulado nos vasos por 30 min. Os plugues de gel de matriz são coletados e embebidos com gel de incorporação de tecido, em seguida, cortes de 12 μm são cortados para detecção de fluorescência sem coloração. Neste ensaio, dextran-FITC com alto peso molecular (~150.000 Da) pode ser usado para indicar vasos funcionais para detectar seu comprimento, enquanto dextran-FITC com baixo peso molecular (~4.400 Da) pode ser usado para indicar a permeabilidade de neo-vasos. Em conclusão, este protocolo pode fornecer um método confiável e conveniente para o estudo quantitativo da angiogênese in vivo.

Introdução

A angiogênese, processo de formação de neovasos a partir de vasos pré-existentes, desempenha papel crítico em muitos processos fisiológicos e patológicos, como desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, aterosclerose, desenvolvimento tumoral, etc.1,2,3,4,5. Esse processo dinâmico envolve várias etapas, incluindo a degradação da matriz, proliferação de células vasculares, migração e auto-organização para formar estruturas tubulares e a estabilização dos neovasos⁶. A promoção da angiogênese tem se mostrado fundamental no tratamento do infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e outros tipos de doenças isquêmicas7, enquanto a inibição da angiogênese tem sido considerada uma estratégia promissora no tratamento de^cânceres8 e doenças reumatoides9. A angiogênese tem sido considerada um princípio organizador para a descoberta de^{fármacos 10}. Assim, a construção de um método confiável e conveniente para avaliar a extensão da angiogênese é fundamental para a pesquisa mecânica ou descoberta de drogas em doenças dependentes de angiogênese.

Vários modelos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para avaliar a angiogênese11. Dentre estes, modelos bidimensionais (2-D), como o ensaio de formação de tubos de gel de matriz¹², não podem formar estruturas tubulares funcionais. Os modelos animais, como o modelo de isquemia de membro^{pélvico13,14}, podem reproduzir o processo de angiogênese, mas são complexos e requerem um sistema de imagem de fluxo sanguíneo pontilhado a laser. Modelos 3D de morfogênese vascular, como o matrix gel plug assay, fornecem uma plataforma simples que pode mimetizar o processo de angiogênese in^vivo15, mas a detecção de angiogênese requer imunohistoquímica ou coloração de imunofluorescência16,17,18, que são variáveis e pouco visualizadas.

Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio de plugue de gel de matriz modificado onde células vasculares foram misturadas com gel de matriz e injetadas subcutaneamente no dorso de camundongos para formar um plug. No plug, as células vasculares precisam degradar a matriz, proliferar, migrar e se auto-organizar para finalmente formar vasos funcionais com fluxo sanguíneo no ambiente interno. Depois disso, o dextran fluorescente é injetado através da veia da cauda, para fluir através do plugue, e o rótulo é visualizado para indicar neo-vasos. O conteúdo da angiogênese pode ser avaliado quantitativamente pelo comprimento dos vasos. Esse método pode formar vasos funcionais que não podem ser produzidos em modelos de angiogênese^2D12 e não necessita de processos complexos de coloração como no ensaio de plugue de gel de matriz^comum11. Também não requer instrumentos específicos de alto custo, como o laser speckle blood flow imaging system no modelo de isquemia de membro pélvico13,14,19. Este método é versátil, de baixo custo, quantificável e de fácil execução, podendo ser utilizado para determinar a capacidade pró ou antiangiogênica de fármacos ou ser utilizado em pesquisas mecânicas envolvidas na angiogênese.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 de julho de 2021). Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparo do meio de cultura

1. Meio de cultura 10x M199: Dissolver o pó M199 na concentração de 10x com 90 mL de água deionizada e adicionar 10 mL de soro fetal bovino (SFB), passando em seguida por um filtro de 0,22 μm. Conservar o meio a 4 °C até 2 meses.
2. Meio de cultura endotelial completo: Adicionar 50 mL de SFB, 5 mL de penicilina/estreptomicina e 5 mL de suplemento de crescimento de células endoteliais a 460 mL de meio de células endoteliais (MEC). Conservar o meio a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.

2. Preparo celular vascular

1. Cultura 1 x 10⁵ células vasculares (células progenitoras endoteliais primárias¹⁴, células endoteliais ou linhagens de células endoteliais) com 8 mL de meio de cultura endotelial completo em placa de cultura de tecido de 100 mm a 37 °C e 5% de CO₂ a 70% de confluência.
2. Retire o meio de cultura e lave a placa 2x com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover células e detritos não aderidos. Retirar o PBS e adicionar 3 mL de tripsina a 0,25% contendo EDTA 2,21 mM e incubar a 37 °C por 1 min.
3. Neutralizar a tripsina com 7 mL de meio de cultura endotelial completo e enxaguar suavemente as células da placa de cultura. Confirmar o descolamento celular ao microscópio de luz (aumento de 40x).
4. Recolher a suspensão celular num tubo de 15 ml e centrifugar a 400 x g durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio de cultura endotelial completo.
5. Contar células usando um hemocitômetro e mover a suspensão contendo 2 x 10⁶ células para um tubo estéril de 1,5 mL. Cada plugue contém 1,5 x 10⁶ células, 25% adicionais são usadas células em caso de resíduos. Cada grupo inclui pelo menos 3 plugues.
   NOTA: Após ensaios, verificou-se que 1,5 x 10⁶ células em 300 μL de gel de matriz levou ao desenvolvimento adequado da angiogênese e, portanto, foi escolhido para experimentação.
6. Centrifugar a suspensão de células a 400 x g por 5 min para células de pellet e, em seguida, remover o sobrenadante.

3. Preparação do gel da matriz

1. Pré-resfriar tubos estéreis de 1,5 mL contendo pellet de células em banho-maria a 4 °C. Pré-resfriar seringas de insulina de 30G 1 mL em geladeira a 4 °C.
2. Descongelar completamente o gel de matriz em banho-maria a 4 °C. Não misture ou vórtice. Pré-resfriar 10x M199 e testar reagente/droga de interesse em banho-maria a 4 °C.
3. Misturar o gel de matriz pré-resfriado com 10x M199 contendo 10% de FBS e o reagente a ser testado na proporção de volume de 8,8:1:0,2 para obter um gel de matriz e uma mistura M199 contendo 1% de FBS e o reagente.
4. Ressuspenda as células com 400 μL da mistura de gel de matriz, misture suavemente para evitar a formação de bolhas. Mantenha o tubo no gelo até que os ratos estejam preparados para a injeção. Mantenha a mistura de gel de matriz no gelo o tempo todo para evitar coagulação.
   NOTA: Aqui, 300 μL de mistura de gel de matriz contendo 1,5 x 10⁶ células foram usados para formar plugue de gel. Prepare 25% de gel extra de acordo com 25% de células adicionais na etapa 2.

4. Preparação do rato

1. Anestesiar camundongos Nu/Nu machos de 6-8 semanas de idade (18-25 g) na câmara do dispositivo de anestesia animal com isoflurano (isoflurano a 3% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L/min). Após anestesia bem-sucedida, confirmada pela ausência de reflexo de retificação e reflexo de pinça dos dedos, mova o camundongo para fora da câmara, mova o mouse para fora da câmara e coloque uma máscara de anestesia no camundongo e altere a concentração de isoflurano para 1,5% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L/min.
   OBS: Fornecer suporte térmico ao animal utilizando uma almofada de aquecimento durante todo o procedimento.
2. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Tape os membros dos ratos na placa de operação na posição prona.

5. Injeção de mistura de gel de matriz

1. Carregar 300 μL da mistura de gel de matriz em uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha 30G. Evite a formação de bolhas. Carregue rapidamente o gel de matriz (dentro de 2 min) para evitar a solidificação durante este tempo. Coloque imediatamente a seringa de insulina carregada com gel de matriz no gelo.
2. Limpe a pele nas costas dos ratos usando almofadas de álcool a 75%. Injetar por via subcutânea 300 μL de mistura de gel de matriz em um lado do dorso de camundongos.
3. Retire suavemente a agulha do local de injeção para evitar a fuga da mistura de gel de matriz. Verifique se há uma pequena corcova no local da injeção (Figura 1).
4. Coloque o mouse na almofada de aquecimento por 2 min para deixar a mistura de gel de matriz coagular e formar plug.
5. Repita as etapas 5.2. ao ponto 5.4. para criar plugue no outro lado da parte de trás do mouse. Marque as bordas das corcovas usando uma caneta marcadora.
6. Observe o camundongo até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Coloque o rato numa gaiola separada até que esteja totalmente recuperado. Alojar os camundongos em laboratório experimental de animais da classe SPF a 22 ± 2 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h por 7 dias.

6. Injeção de Dextran-FITC através da veia caudal

1. Após 7 dias da injeção do gel de matriz, ressuspender 0,5 mg de dextran-FITC com 500 μL de água bidestilada (ddH₂O) e, em seguida, vórtice violento para obter a solução de dextran-FITC na concentração final de 1 μg/μL.
   NOTA: Use dextran-FITC com peso molecular de ~150 kDa para o ensaio de angiogênese, e use dextran-FITC com peso molecular de ~4 kDa para o ensaio de permeabilidade vascular.
2. Carregar 50 μL de solução de dextran-FITC nas seringas de 29G.
3. Fixe o mouse no instrumento de injeção da veia da cauda. Limpe a cauda com algodão com álcool 75% e injete suavemente 50 μL de dextran-FITC através da veia da cauda.
4. Comprimir o local de injeção com cotonete por 1 min para estancar o sangramento e, em seguida, colocar os camundongos de volta na gaiola por 30 minutos.
5. Repita as etapas 6.3. e 6.4. até que todos os camundongos tenham recebido injeção de dextran-FITC.

7. Coleta do plugue de gel Matrix

1. Injetar por via intraperitoneal pentobarbital sódico a 1% em PBS (200 mg/kg de peso corporal) e eutanasiar os camundongos com um procedimento aprovado pela IACUC.
2. Corte a pele ao longo da borda marcada do plugue usando tesoura cirúrgica e remova a pele acima do plugue de gel de matriz.
3. Recolher o tampão e enxaguar num copo pequeno com 1x PBS para lavar o excesso de sangue (Figura 2A). A cor do tampão pode delinear grosseiramente o grau de abundância sanguínea e o conteúdo dos neovasos (Figura 3A).

8. Incorporação de plugue de gel de matriz e preparação de seção

1. Cubra o botão do de incorporação de tecido com cerca de 0,5 mL de gel de incorporação de tecido e, em seguida, coloque imediatamente o plugue de gel de matriz no gel de incorporação de tecido na orientação desejada, conforme mostrado na Figura 2B. Em seguida, incorpore o plugue com gel de incorporação de tecido adicional.
2. Coloque os em um freezer de -80 °C por 12 h para solidificar.
3. Para a preparação de seções espessas, retire o bloco de plugue solidificado e corte seções de 12 μm de espessura usando o micrótomo de congelamento de acordo com a instrução e monte em lâminas de microscópio.
4. Corte de 5 a 10 seções de cada bloco de plugue.

9. Quantificação da angiogênese (Figura 3)

1. Adquira imagens de fluorescência de 5 campos independentes da seção com um microscópio de fluorescência invertida no comprimento de onda de 488 nm sob aumento de 10x.
2. Abra o arquivo de imagem com o software Image J (https://imagej.en.softonic.com/) e clique no botão Angiogenesis Analyze . Em seguida, clique no botão Analisar contraste de fase do HUVEC e alterne para Tabela de resultados do stat para coletar informações. Meça todas as 5 imagens de fluorescência adquiridas para cada seção.
3. Analisar o comprimento total dos neovasos dos diferentes grupos para avaliar estatisticamente a diferença na angiogênese entre esses grupos.
   NOTA: O comprimento total dos segmentos mestre indica o comprimento total dos neo-vasos. O reagente que aumenta o comprimento dos neovasos é denominado pró-angiogênico, enquanto o reagente que diminui o comprimento dos neovasos é antiangiogênico.

10. Quantificação da permeabilidade vascular (Figura 4)

1. Adquira imagens de fluorescência de 5 campos independentes da seção com um microscópio de fluorescência invertida no comprimento de onda de 488 nm sob aumento de 20x.
2. Abra o arquivo de imagem com o software Image J. Clique no botão Seleção à mão livre e circule a área de vazamento, clique no menu Analisar e selecione a opção Medir para obter as informações da área de vazamento. Use a razão entre a área de vazamento e a área de imagem para indicar a permeabilidade vascular.
3. Analisar a relação entre a área de vazamento e a área da imagem dos diferentes grupos para avaliar estatisticamente a diferença de permeabilidade vascular entre esses grupos.

Resultados

A Figura 1 é o fluxograma descrevendo como preparar a mistura de gel de matriz, células vasculares, meio de cultura e reagente. A mistura foi então injetada por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu e aquecida usando uma almofada de aquecimento para acelerar sua coagulação e, finalmente, formar plugue de gel.

A Figura 2A é o fluxograma para indicar vasos com dextrano marcado fluorescente. O dextran fluorescente marcado f...

Discussão

Apresentamos um método confiável e conveniente para a avaliação quantitativa da angiogênese in vivo sem coloração. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu para formar plugue de gel (Figura 1). Após 7 dias da formação do plugue de gel, o dextran-FITC foi injetado por via intravenosa e circulado por 30...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF