Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi

Riepilogo

Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.

Abstract

Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare l'angiogenesi in vivo. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli sono complessi e costosi, richiedono attrezzature specializzate o sono difficili da eseguire per la successiva analisi quantitativa. Qui presentiamo un saggio di gel plug a matrice modificata per valutare l'angiogenesi in vivo. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza o assenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi riceventi. Dopo 7 giorni, la soluzione salina tampone fosfato contenente destrano-FITC viene iniettata attraverso la vena caudale e fatta circolare nei vasi per 30 minuti. I tappi di gel della matrice vengono raccolti e incorporati con gel di inclusione tissutale, quindi vengono tagliate sezioni da 12 μm per la rilevazione della fluorescenza senza colorazione. In questo test, il destrano-FITC ad alto peso molecolare (~150.000 Da) può essere utilizzato per indicare i vasi funzionali per rilevarne la lunghezza, mentre il destrano-FITC a basso peso molecolare (~4.400 Da) può essere utilizzato per indicare la permeabilità dei neo-vasi. In conclusione, questo protocollo può fornire un metodo affidabile e conveniente per lo studio quantitativo dell'angiogenesi in vivo.

Introduzione

L'angiogenesi, il processo di formazione di neovasi da vasi preesistenti, svolge un ruolo fondamentale in molti processi fisiologici e patologici, come lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, l'aterosclerosi, lo sviluppo del tumore, ecc.1,2,3,4,5. Questo processo dinamico coinvolge diverse fasi, tra cui la degradazione della matrice, la proliferazione delle cellule vascolari, la migrazione e l'auto-organizzazione per formare strutture tubulari e la stabilizzazione dei neo-vasi⁶. È stato dimostrato che la promozione dell'angiogenesi è fondamentale nel trattamento dell'infarto del miocardio, dell'ictus e di altri tipi di malattie ischemiche⁷, mentre l'inibizione dell'angiogenesi è stata considerata una strategia promettente nel trattamento dei tumori⁸ e delle malattie reumatoidi⁹. L'angiogenesi è stata considerata un principio organizzativo per la scoperta di farmaci¹⁰. Pertanto, la costruzione di un metodo affidabile e conveniente per valutare l'estensione dell'angiogenesi è fondamentale per la ricerca meccanica o la scoperta di farmaci nelle malattie dipendenti dall'angiogenesi.

Diversi modelli in vitro e in vivo sono stati sviluppati per valutare l'angiogenesi¹¹. Tra questi, i modelli bidimensionali (2-D), come il test di formazione di tubi di gel a matrice¹², non possono formare strutture tubolari funzionali. I modelli animali, come il modello di ischemia^degli arti posteriori ^13,14, possono riprodurre il processo di angiogenesi, ma sono complessi e richiedono un sistema di imaging del flusso sanguigno a speckle laser. I modelli 3D della morfogenesi vascolare, come il saggio del gel plug della matrice, forniscono una piattaforma semplice in grado di imitare il processo di angiogenesi in vivo¹⁵, ma il rilevamento dell'angiogenesi richiede l'immunoistochimica o la colorazione a immunofluorescenza 16,17,18, che sono variabili e scarsamente visualizzate.

Qui, descriviamo un protocollo per un saggio di gel di matrice modificata in cui le cellule vascolari sono state mescolate con gel di matrice e iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi per formare un tappo. Nel tappo, le cellule vascolari devono degradare la matrice, proliferare, migrare e auto-organizzarsi per formare infine vasi funzionali con flusso sanguigno nell'ambiente interno. Successivamente, il destrano marcato con fluorescenza viene iniettato attraverso la vena caudale, per fluire attraverso il tappo, e l'etichetta viene visualizzata per indicare i neo-vasi. Il contenuto dell'angiogenesi può essere valutato quantitativamente in base alla lunghezza dei vasi. Questo metodo è in grado di formare vasi funzionali che non possono essere prodotti nei modelli di angiogenesi 2D¹² e non richiede un complesso processo di colorazione come nel normale saggio del gel plug^{della matrice 11}. Inoltre, non richiede costosi strumenti specifici come il sistema di imaging del flusso sanguigno a speckle laser nel modello di ischemia dell'arto posteriore 13,14,19. Questo metodo è versatile, a basso costo, quantificabile e facile da eseguire e può essere utilizzato per determinare la capacità pro- o anti-angiogenica dei farmaci o essere utilizzato nella ricerca meccanica coinvolta nell'angiogenesi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 luglio 2021). Tutti i reagenti e i materiali di consumo sono elencati nell'Indice dei materiali.

1. Preparazione del terreno di coltura

1. 10 terreni di coltura M199: sciogliere la polvere di M199 a una concentrazione di 10 volte con 90 mL di acqua deionizzata e aggiungere 10 mL di siero fetale bovino (FBS), quindi passare attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare il terreno a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
2. Terreno di coltura endoteliale completo: aggiungere 50 mL di FBS, 5 mL di penicillina/streptomicina e 5 mL di integratore per la crescita delle cellule endoteliali a 460 mL di terreno endoteliale (ECM). Conservare il terreno a 4 °C per un massimo di 1 mese.

2. Preparazione delle cellule vascolari

1. Coltura 1 x 10⁵ cellule vascolari (cellule progenitrici endoteliali primarie in coltura¹⁴, cellule endoteliali o linee cellulari endoteliali) con 8 mL di terreno di coltura endoteliale completo in piastra di coltura tissutale da 100 mm a 37 °C e confluenza dal 5% di CO₂ al 70%.
2. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare la piastra 2 volte con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere le cellule e i detriti non attaccati. Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina allo 0,25% contenente 2,21 mM di EDTA e incubare a 37 °C per 1 min.
3. Neutralizzare la tripsina con 7 mL di terreno di coltura endoteliale completo e risciacquare delicatamente le cellule dal piatto di coltura. Confermare il distacco cellulare al microscopio ottico (ingrandimento 40x).
4. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 5 mL di terreno di coltura endoteliale completo.
5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e spostare la sospensione contenente 2 x 10⁶ cellule in una provetta sterile da 1,5 mL. Ogni tappo contiene 1,5 x 10^{celle da 6} , in caso di scarto vengono utilizzate celle aggiuntive del 25%. Ogni gruppo comprende almeno 3 spine.
   NOTA: Dopo le prove è stato riscontrato che 1,5 x 10⁶ cellule in 300 μL di gel di matrice hanno portato al corretto sviluppo dell'angiogenesi ed è stato quindi scelto per la sperimentazione.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti fino a pellet di cellule, quindi rimuovere il surnatante.

3. Preparazione del gel Matrix

1. Preraffreddare provette sterili da 1,5 mL contenenti pellet cellulare in un bagno d'acqua a 4 °C. Preraffreddare le siringhe da insulina da 30 G da 1 mL in frigorifero a 4 °C.
2. Scongelare completamente il gel della matrice a bagnomaria a 4 °C. Non mescolare o vorticare. Preraffreddare 10x M199 e testare il reagente/farmaco di interesse in un bagno d'acqua a 4 °C.
3. Miscelare il gel a matrice preraffreddato con 10x M199 contenente il 10% di FBS e il reagente da testare con un rapporto di volume di 8,8:1:0,2 per ottenere un gel di matrice e una miscela di M199 contenente l'1% di FBS e il reagente.
4. Risospendere le cellule con 400 μL della miscela di gel della matrice, mescolare delicatamente per evitare la formazione di bolle. Tenere la provetta sul ghiaccio fino a quando i topi non sono pronti per l'iniezione. Tenere sempre la miscela di gel della matrice sul ghiaccio per evitare la coagulazione.
   NOTA: In questo caso, sono stati utilizzati 300 μL di miscela di gel a matrice contenente 1,5 x 10⁶ cellule per formare il tappo di gel. Preparare il 25% di gel in più in base al 25% di cellule aggiuntive nel passaggio 2.

4. Preparazione del topo

1. Anestetizzare il topo Nu/Nu maschio di 6-8 settimane (18-25 g) nella camera del dispositivo per anestesia animale con isoflurano (isoflurano al 3% in ossigeno al 100% ad una portata di 1 L/min). Dopo l'anestesia riuscita, confermata dall'assenza del riflesso di raddrizzamento e del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi, spostare il topo fuori dalla camera, spostare il topo fuori dalla camera e mettere una maschera per anestesia sul topo e modificare la concentrazione di isoflurano all'1,5% in ossigeno al 100% a una portata di 1 L/min.
   NOTA: Fornire supporto termico all'animale utilizzando un termoforo durante tutta la procedura.
2. Usa un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Fissare con nastro adesivo gli arti dei topi sulla scheda operatoria in posizione prona.

5. Iniezione di miscela di gel a matrice

1. Caricare 300 μL della miscela di gel matrice in una siringa da insulina da 1 mL con un ago da 30 G. Evitare la formazione di bolle. Caricare rapidamente il gel della matrice (entro 2 minuti) per evitare la solidificazione durante questo periodo. Posizionare immediatamente la siringa da insulina caricata con il gel matrice sul ghiaccio.
2. Pulisci la pelle sul dorso dei topi usando tamponi imbevuti di alcol al 75%. Iniettare per via sottocutanea 300 μL di miscela di gel matrice in un lato della parte posteriore dei topi.
3. Rimuovere delicatamente l'ago dal sito di iniezione per evitare perdite della miscela di gel della matrice. Verificare la presenza di una piccola gobba nel sito di iniezione (Figura 1).
4. Posizionare il mouse sul termoforo per 2 minuti per consentire alla miscela di gel della matrice di coagularsi e formare il tappo.
5. Ripetere i passaggi 5.2. fino al punto 5.4. per creare una spina sull'altro lato del retro del mouse. Segna i bordi delle gobbe usando un pennarello.
6. Osservare il topo fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere il decubito sternale. Metti il mouse in una gabbia separata fino a quando non si è completamente ripreso. Alloggiare i topi in un laboratorio di animali da esperimento di classe SPF a 22 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore per 7 giorni.

6. Iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale

1. Dopo 7 giorni di iniezione del gel di matrice, sospendere nuovamente 0,5 mg di destrano-FITC con 500 μL di acqua bidistillata (ddH₂O) e quindi vorticare violentemente per ottenere la soluzione di destrano-FITC alla concentrazione finale di 1 μg/μL.
   NOTA: Utilizzare destrano-FITC con peso molecolare di ~150 kDa per il test di angiogenesi e utilizzare destrano-FITC con peso molecolare di ~4 kDa per il test di permeabilità vascolare.
2. Caricare 50 μL di soluzione di destrano-FITC nelle siringhe da 29G.
3. Fissare il mouse sullo strumento per l'iniezione della vena caudale. Pulire la coda con un batuffolo di cotone alcool al 75% e iniettare delicatamente 50 μL di destrano-FITC attraverso la vena caudale.
4. Comprimere il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per 1 minuto per fermare l'emorragia, quindi rimettere i topi nella gabbia per 30 minuti.
5. Ripetere i passaggi 6.3. e 6.4. fino a quando tutti i topi non hanno ricevuto l'iniezione di destrano-FICC.

7. Raccolta di tappi in gel Matrix

1. Iniettare per via intraperitoneale l'1% di pentobarbital sodico in PBS (200 mg/kg di peso corporeo) ed eutanasia i topi con una procedura approvata dalla IACUC.
2. Tagliare la pelle lungo il bordo contrassegnato del tappo usando le forbici chirurgiche e rimuovere la pelle sopra il tappo in gel della matrice.
3. Raccogliere il tappo e sciacquare in un piccolo becher con 1x PBS per lavare via il sangue in eccesso (Figura 2A). Il colore del tappo può delineare approssimativamente il grado di abbondanza di sangue e il contenuto dei neovasi (Figura 3A).

8. Inclusione del tappo in gel della matrice e preparazione della sezione

1. Coprire il pulsante della cassetta di inclusione dei tessuti con circa 0,5 mL di gel per l'inclusione dei tessuti, quindi posizionare immediatamente il tappo in gel per matrice sul gel per l'inclusione dei tessuti nell'orientamento desiderato, come mostrato nella Figura 2B. Quindi, incorporare il tappo con un gel aggiuntivo per l'inclusione dei tessuti.
2. Mettere le cassette in un congelatore a -80 °C per 12 ore a solidificare.
3. Per la preparazione di sezioni spesse, estrarre il blocco di tappi solidificato e tagliare sezioni spesse 12 μm utilizzando il microtomo di congelamento secondo le istruzioni e montarle sui vetrini del microscopio.
4. Taglia 5-10 sezioni da ogni blocco di spine.

9. Quantificazione dell'angiogenesi (Figura 3)

1. Acquisisci immagini di fluorescenza da 5 campi indipendenti della sezione con un microscopio a fluorescenza invertita a una lunghezza d'onda di 488 nm con un ingrandimento di 10x.
2. Aprire il file immagine con il software Image J (https://imagej.en.softonic.com/) e fare clic sul pulsante Analisi angiogenesi. Quindi, fare clic sul pulsante Analizza contrasto di fase HUVEC e passare alla tabella dei risultati delle statistiche per raccogliere informazioni. Misurare tutte e 5 le immagini di fluorescenza acquisite per ciascuna sezione.
3. Analizzare la lunghezza totale dei neovasi di diversi gruppi per valutare statisticamente la differenza di angiogenesi tra questi gruppi.
   NOTA: La lunghezza totale dei segmenti master indica la lunghezza totale dei neo-vasi. Il reagente che aumenta la lunghezza dei neovasi è definito pro-angiogenico, mentre il reagente che diminuisce la lunghezza dei neo-vasi è anti-angiogenico.

10. Quantificazione della permeabilità vascolare (Figura 4)

1. Acquisizione di immagini di fluorescenza da 5 campi indipendenti della sezione con un microscopio a fluorescenza invertita a una lunghezza d'onda di 488 nm con un ingrandimento di 20x.
2. Aprire il file immagine con il software Image J. Fare clic sul pulsante Selezione a mano libera e cerchiare l'area di perdita, quindi fare clic sul menu Analizza e selezionare l'opzione Misura per ottenere le informazioni sull'area dell'area di perdita. Utilizzare il rapporto tra l'area di perdita e l'area dell'immagine per indicare la permeabilità vascolare.
3. Analizzare il rapporto tra l'area di perdita e l'area dell'immagine da diversi gruppi per valutare statisticamente la differenza di permeabilità vascolare tra questi gruppi.

Risultati

La Figura 1 è il diagramma di flusso che illustra come preparare la miscela di gel della matrice, cellule vascolari, terreno di coltura e reagente. La miscela è stata quindi iniettata per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu e riscaldata utilizzando un termoforo per accelerarne la coagulazione e formare infine un tappo di gel.

La Figura 2A è il diagramma di flusso per indicare i recipienti con destrano marcato con...

Discussione

Presentiamo un metodo affidabile e conveniente per la valutazione quantitativa dell'angiogenesi in vivo senza colorazione. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu per formare un tappo di gel (Figura 1). Dopo 7 giorni dalla formazione del tappo di gel, il destrano-FITC è stato iniettato per via endovenosa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF