Модифицированный матричный гель-пробка in vivo для исследований ангиогенеза

Резюме

Представленный здесь метод позволяет оценить влияние реагентов на ангиогенез или проницаемость сосудов in vivo без окрашивания. Метод использует инъекцию декстрана-FITC через хвостовую вену для визуализации неососудов или сосудистой утечки.

Аннотация

Было разработано несколько моделей для исследования ангиогенеза in vivo. Однако большинство из этих моделей сложны и дороги, требуют специализированного оборудования или сложны в выполнении для последующего количественного анализа. Здесь мы представляем модифицированный матричный гель-пробка для оценки ангиогенеза in vivo. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии или отсутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей-реципиентов. Через 7 дней через хвостовую вену вводят фосфатный солевой раствор, содержащий декстран-ФИТК, и циркулируют в сосудах в течение 30 мин. Матричные гелевые пробки собираются и помещаются в тканевый гель для встраивания, затем нарезаются срезы по 12 мкм для обнаружения флуоресценции без окрашивания. В этом анализе декстран-FITC с высокой молекулярной массой (~150 000 Да) может быть использован для обозначения функциональных сосудов для определения их длины, в то время как декстран-ФИТК с низкой молекулярной массой (~4 400 Да) может быть использован для обозначения проницаемости неососудов. В заключение можно сказать, что данный протокол может обеспечить надежный и удобный метод количественного изучения ангиогенеза in vivo.

Введение

Ангиогенез, процесс образования новых сосудов из ранее существовавших сосудов, играет важнейшую роль во многих физиологических и патологических процессах, таких как эмбриональное развитие, заживление ран, атеросклероз, развитие опухолей и т.д.1,2,3,4,5. Этот динамический процесс включает в себя несколько этапов, включая деградацию матрикса, пролиферацию сосудистых клеток, миграцию и самоорганизацию для формирования трубчатых структур и стабилизацию новых сосудов⁶. Было продемонстрировано, что стимулирование ангиогенеза имеет решающее значение при лечении инфаркта миокарда, инсульта и других видов ишемических^{заболеваний7}, в то время как ингибирование ангиогенеза считается перспективной стратегией в лечении^рака8 и ревматоидных заболеваний⁹. Ангиогенез считается организующим принципом для открытия лекарств¹⁰. Таким образом, создание надежного и удобного метода оценки степени ангиогенеза имеет решающее значение для механических исследований или разработки лекарств при ангиогенез-зависимых заболеваниях.

Для оценки ангиогенеза было разработано несколько моделей in vitro и in vivo ¹¹. Среди них двумерные (2-D) модели, такие как матричная гелевая трубка¹², не могут формировать функциональные трубчатые структуры. Животные модели, такие как модель ишемии задних конечностей ^13,14, могут воспроизводить процесс ангиогенеза, но сложны и требуют лазерной системы визуализации кровотока. 3D-модели морфогенеза сосудов, такие как матричный гель-пробка, предоставляют простую платформу, которая может имитировать процесс ангиогенеза in vivo¹⁵, но для обнаружения ангиогенеза требуется иммуногистохимия или иммунофлуоресцентное окрашивание 16,17,18, которые являются вариабельными и плохо визуализируются.

Здесь мы опишем протокол модифицированного анализа матричной гелевой пробки, при котором сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем и подкожно вводили в заднюю часть мышей для формирования пробки. В пробке сосудистые клетки должны разрушать матрикс, пролиферировать, мигрировать и самоорганизовываться, чтобы, наконец, сформировать функциональные сосуды с током крови во внутренней среде. После этого флуоресцентно меченый декстран вводится через хвостовую вену, чтобы протекать через пробку, и метка визуализируется, чтобы указать на неососуды. Содержание ангиогенеза можно количественно оценить по длине сосудов. Этот метод может формировать функциональные сосуды, которые не могут быть получены в 2-D моделях ангиогенеза¹², и не требует сложного процесса окрашивания, как в обычном матричном гелевом пробке¹¹. Он также не требует дорогостоящих специальных инструментов, таких как лазерная система визуализации кровотока при ишемии задних конечностей модели 13,14,19. Этот метод является универсальным, недорогим, поддающимся количественной оценке и простым в исполнении, и может быть использован для определения про- или антиангиогенной способности лекарств или может быть использован в механических исследованиях, участвующих в ангиогенезе.

протокол

Все^{процедуры, связанные} с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского университета Вэньчжоу (XMSQ2021-0057, 19 июля 2021 г.). Все реактивы и расходные материалы перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление питательной среды

1. 10-кратная питательная среда M199: Растворите порошок M199 до 10-кратной концентрации с 90 мл деионизированной воды и добавьте 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), затем пропустите через фильтр 0,22 мкм. Хранить средство при температуре 4 °C до 2 месяцев.
2. Полная эндотелиальная питательная среда: добавьте 50 мл FBS, 5 мл пенициллина/стрептомицина и 5 мл добавки для роста эндотелиальных клеток к 460 мл эндотелиальной клеточной среды (ECM). Хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.

2. Подготовка сосудистых клеток

1. Культивирование 1 x 10⁵ сосудистых клеток (первичные культивируемые эндотелиальные клетки-предшественники¹⁴, эндотелиальные клетки или линии эндотелиальных клеток) с 8 мл полной эндотелиальной питательной среды в 100 мм тканевой культуральной чашке при 37 °C и слиянии 5% CO_{от 2} до 70%.
2. Удалите питательную среду и промойте чашку 2 раза 1 фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить неприкрепленные клетки и мусор. Удалить PBS и добавить 3 мл 0,25% трипсина, содержащего 2,21 мМ ЭДТА, и инкубировать при 37 °C в течение 1 мин.
3. Нейтрализуйте трипсин 7 мл полной эндотелиальной питательной среды и осторожно смойте клетки с чашки для культивирования. Подтвердите отслоение клеток под световым микроскопом (40-кратное увеличение).
4. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при концентрации 400 x g в течение 10 мин. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки с помощью 5 мл полной эндотелиальной питательной среды.
5. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и переместите суспензию, содержащую 2 x 10,⁶ клеток, в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Каждая заглушка содержит ячейки 1,5 х 10⁶ , дополнительные 25% ячеек используются на случай отходов. Каждая группа включает в себя не менее 3 заглушек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После испытаний было обнаружено, что клетки 1,5 x 10,6 в 300 мкл матричного геля приводят к правильному развитию ангиогенеза, и поэтому были выбраны для эксперимента.
6. Центрифужную клеточную суспензию при 400 х г в течение 5 мин до гранулированных клеток, а затем удаляют надосадочную жидкость.

3. Приготовление матричного геля

1. Предварительно охладите стерильные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие клеточные гранулы, на водяной бане с температурой 4 °C. Предварительно охладите инсулиновые шприцы 30 г по 1 мл в холодильнике с температурой 4 °C.
2. Полностью разморозьте матричный гель на водяной бане с температурой 4 °C. Не смешивайте и не перемешивайте. Предварительно охладите 10x M199 и исследуйте реагент/препарат на водяной бане с температурой 4 °C.
3. Смешайте предварительно охлажденный матричный гель с 10х М199, содержащим 10% ФБС, и реагентом, подлежащим испытанию, в объемном соотношении 8,8:1:0,2, чтобы получить матричный гель и смесь М199, содержащую 1% ФБС и реагент.
4. Ресуспендируйте клетки с 400 мкл матричной гелевой смеси, аккуратно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков. Держите трубку на льду до тех пор, пока мыши не будут подготовлены к инъекции. Постоянно держите матричную гелевую смесь на льду, чтобы избежать коагуляции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для формирования гелевой пробки использовали 300 мкл матричной гелевой смеси, содержащей ячейки 1,5 x 10⁶ . Приготовьте 25% дополнительного геля в соответствии с 25% дополнительными клетками на шаге 2.

4. Подготовка мыши

1. Обезболить 6-8-недельного самца Nu/Nu мышей (18-25 г) в камере наркозного аппарата животного изофлураном (3% изофлурана в 100% кислороде при скорости потока 1 л/мин). После успешного обезболивания, подтвержденного отсутствием выпрямляющего рефлекса и щипкового рефлекса, мышь выводят из камеры, выводят мышь из камеры и надевают на мышь наркозную маску и изменяют концентрацию изофлурана до 1,5% в 100% кислороде при расходе 1 л/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте животному тепловую поддержку с помощью грелки на протяжении всей процедуры.
2. Наносите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. Заклейте конечности мышей на операционной доске в положении лежа.

5. Впрыск матричной гелевой смеси

1. Загрузить 300 мкл матричной гелевой смеси в инсулиновый шприц объемом 1 мл иглой 30G. Избегайте образования пузырьков. Быстро загрузите матричный гель (в течение 2 минут), чтобы избежать застывания в течение этого времени. Немедленно поместите инсулиновый шприц, наполненный матричным гелем, на лед.
2. Очистите кожу на спине мышей с помощью 75% спиртовых салфеток. Подкожно вводят 300 мкл матричной гелевой смеси в одну сторону спины мышей.
3. Аккуратно извлеките иглу из места инъекции, чтобы не допустить утечки матричной гелевой смеси. Проверьте, нет ли небольшой горбинки в месте инъекции (рисунок 1).
4. Поместите мышь на грелку на 2 минуты, чтобы матричная гелевая смесь коагулировала и образовала пробку.
5. Повторите шаги 5.2. до 5.4. , чтобы создать заглушку на другой стороне задней панели мыши. Отметьте края горбов с помощью маркера.
6. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не придет в сознание настолько, чтобы поддерживать положение грудины. Поместите мышь в отдельную клетку до полного выздоровления. Поместите мышей в лабораторию для экспериментальных животных SPF-класса при температуре 22 ± 2 °C с 12-часовым циклом света и темноты в течение 7 дней.

6. Инъекция декстрана-ФИТК через хвостовую вену

1. Через 7 дней введения матричного геля повторно суспендировать 0,5 мг декстрана-FITC с 500 мкл двойной дистиллированной воды (ddH₂O), а затем сильно вихрнуть для получения раствора декстрана-FITC в конечной концентрации 1 мкг/мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте декстран-FITC с молекулярной массой ~150 кДа для анализа ангиогенеза и используйте декстран-FITC с молекулярной массой ~4 кДа для анализа проницаемости сосудов.
2. Загрузите 50 мкл раствора декстрана-ФИТК в шприцы 29G.
3. Зафиксируйте мышь на инструменте для инъекции в хвостовую вену. Очистите хвост ватным тампоном с содержанием 75% спирта и аккуратно введите 50 мкл декстрана-FITC через хвостовую вену.
4. Прижмите место укола ватным тампоном на 1 минуту, чтобы остановить кровотечение, а затем поместите мышей обратно в клетку на 30 минут.
5. Повторите шаги 6.3. и 6.4. до тех пор, пока все мыши не получат инъекцию декстрана-FITC.

7. Коллекция матричных гелевых пробок

1. Внутрибрюшинно вводят 1% пентобарбитал натрия в PBS (200 мг/кг массы тела) и усыпляют мышей с помощью процедуры, одобренной IACUC.
2. Разрежьте кожу по отмеченной границе пробки хирургическими ножницами и удалите кожу над матричной гелевой пробкой.
3. Соберите пробку и промойте в небольшом стакане с 1x PBS, чтобы смыть лишнюю кровь (Рисунок 2A). По цвету пробки можно примерно очертить степень обилия крови и содержание неососудов (рис. 3А).

8. Подготовка закладной и секции матрицы

1. Накройте кнопку кассеты для встраивания ткани примерно 0,5 мл геля для заделки ткани, затем немедленно поместите заглушку матричного геля на гель для встраивания ткани в желаемой ориентации, как показано на рисунке 2B. Затем вставьте заглушку с дополнительным гелем для заделки ткани.
2. Поместите кассеты в морозильную камеру при температуре -80 °C на 12 часов для застывания.
3. Для подготовки толстых срезов выньте затвердевший блок пробок и отрежьте срезы толщиной 12 мкм с помощью замораживающего микротома в соответствии с инструкцией, и установите на предметные стекла микроскопа.
4. Отрежьте 5-10 секций от каждого блока вилки.

9. Количественная оценка ангиогенеза (рисунок 3)

1. Получение флуоресцентных изображений из 5 независимых полей разреза с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа на длине волны 488 нм при 10-кратном увеличении.
2. Откройте файл изображения с помощью программы Image J (https://imagej.en.softonic.com/) и нажмите кнопку Angiogenesis Analyze . Затем нажмите кнопку «Анализ фазового контраста HUVEC » и переключитесь на таблицу результатов статистики для сбора информации. Измерьте все 5 полученных флуоресцентных изображений для каждого участка.
3. Проанализируйте общую длину неососудов из разных групп, чтобы статистически оценить разницу в ангиогенезе между этими группами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общая длина мастер-сегментов указывает на общую длину нео-сосудов. Реагент, увеличивающий длину неососудов, называется проангиогенным, в то время как реагент, уменьшающий длину неососудов, является антиангиогенным.

10. Количественная оценка проницаемости сосудов (рис. 4)

1. Получение флуоресцентных изображений из 5 независимых полей разреза с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа на длине волны 488 нм при 20-кратном увеличении.
2. Откройте файл изображения с помощью программы Image J. Нажмите кнопку Freehand Selection (Произвольное выделение ) и обведите область утечки, затем щелкните меню Analyze (Анализ) и выберите опцию Measure (Измерить ), чтобы получить информацию о области утечки. Используйте соотношение площади утечки и площади изображения для обозначения проницаемости сосудов.
3. Проанализируйте соотношение площади утечки и площади изображения из разных групп, чтобы статистически оценить разницу в проницаемости сосудов между этими группами.

Результаты

На рисунке 1 представлена блок-схема, показывающая, как приготовить смесь матричного геля, сосудистых клеток, питательной среды и реагента. Затем смесь подкожно вводили в спину мышей Nu/Nu и нагревали с помощью грелки, чтобы ускорить ее коагуляцию и, наконец, образовать гел...

Обсуждение

Представлен надежный и удобный метод количественной оценки ангиогенеза in vivo без окрашивания. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей Nu/Nu с образованием гел?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF