Модифицированный матричный гель-пробка in vivo для исследований ангиогенеза

Резюме

Представленный здесь метод позволяет оценить влияние реагентов на ангиогенез или проницаемость сосудов in vivo без окрашивания. Метод использует инъекцию декстрана-FITC через хвостовую вену для визуализации неососудов или сосудистой утечки.

Аннотация

Было разработано несколько моделей для исследования ангиогенеза in vivo. Однако большинство из этих моделей сложны и дороги, требуют специализированного оборудования или сложны в выполнении для последующего количественного анализа. Здесь мы представляем модифицированный матричный гель-пробка для оценки ангиогенеза in vivo. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии или отсутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей-реципиентов. Через 7 дней через хвостовую вену вводят фосфатный солевой раствор, содержащий декстран-ФИТК, и циркулируют в сосудах в течение 30 мин. Матричные гелевые пробки собираются и помещаются в тканевый гель для встраивания, затем нарезаются срезы по 12 мкм для обнаружения флуоресценции без окрашивания. В этом анализе декстран-FITC с высокой молекулярной массой (~150 000 Да) может быть использован для обозначения функциональных сосудов для определения их длины, в то время как декстран-ФИТК с низкой молекулярной массой (~4 400 Да) может быть использован для обозначения проницаемости неососудов. В заключение можно сказать, что данный протокол может обеспечить надежный и удобный метод количественного изучения ангиогенеза in vivo.

Введение

Ангиогенез, процесс образования новых сосудов из ранее существовавших сосудов, играет важнейшую роль во многих физиологических и патологических процессах, таких как эмбриональное развитие, заживление ран, атеросклероз, развитие опухолей и т.д.1,2,3,4,5. Этот динамический процесс включает в себя несколько этапов, включая деградацию матрикса, пролиферацию сосудистых клеток, миграцию и самоорганизацию для формирования трубчатых структур и стабилизацию новых сосудов⁶. Было продемонстриро....

протокол

Все^{процедуры, связанные} с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского университета Вэньчжоу (XMSQ2021-0057, 19 июля 2021 г.). Все реактивы и расходные материалы перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление питательной среды

1. 10-кратная питательная среда M199: Растворите порошок M199 до 10-кратной концентрации с 90 мл деионизированной воды и добавьте 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), затем пропустите через фильтр 0,22 мкм. Хранить средство при температуре 4 °C до 2 месяцев.
2. Полная эндотелиальная п....

Результаты

На рисунке 1 представлена блок-схема, показывающая, как приготовить смесь матричного геля, сосудистых клеток, питательной среды и реагента. Затем смесь подкожно вводили в спину мышей Nu/Nu и нагревали с помощью грелки, чтобы ускорить ее коагуляцию и, наконец, образовать гел.......

Обсуждение

Представлен надежный и удобный метод количественной оценки ангиогенеза in vivo без окрашивания. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей Nu/Nu с образованием гел?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF