Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Zusammenfassung

Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Es wurden mehrere Modelle entwickelt, um die Angiogenese in vivo zu untersuchen. Die meisten dieser Modelle sind jedoch komplex und teuer, erfordern spezielle Geräte oder sind für die anschließende quantitative Analyse schwer durchzuführen. Hier präsentieren wir einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay zur Bewertung der Angiogenese in vivo. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken der Empfängermäuse injiziert. Nach 7 Tagen wird Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, die Dextran-FITC enthält, über die Schwanzvene injiziert und 30 Minuten lang in den Gefäßen zirkuliert. Matrix-Gel-Plugs werden gesammelt und mit Gewebeeinbettungsgel eingebettet, dann werden 12-μm-Abschnitte für die Fluoreszenzdetektion ohne Färbung geschnitten. In diesem Assay kann Dextran-FITC mit hohem Molekulargewicht (~150.000 Da) verwendet werden, um funktionelle Gefäße zum Nachweis ihrer Länge anzuzeigen, während Dextran-FITC mit niedrigem Molekulargewicht (~4.400 Da) verwendet werden kann, um die Permeabilität von Neogefäßen anzuzeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine zuverlässige und bequeme Methode für die quantitative Untersuchung der Angiogenese in vivo bieten kann.

Einleitung

Die Angiogenese, der Prozess der Bildung von Neogefäßen aus bereits bestehenden Gefäßen, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Embryonalentwicklung, Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorentwicklung usw.1,2,3,4,5. Dieser dynamische Prozess umfasst mehrere Schritte, darunter den Abbau der Matrix, die Proliferation von Gefäßzellen, die Migration und Selbstorganisation zu röhrenförmigen Strukturen sowie die Stabilisierung der Neogefäße⁶. Die Förderung der Angiogenese hat sich bei der Behandlung von Myokardinfarkt, Schlaganfall und anderen Arten von ischämischen Erkrankungen als entscheidend erwiesen⁷, während die Hemmung der Angiogenese als vielversprechende Strategie bei der Behandlung von Krebs⁸ und rheumatoiden Erkrankungen⁹ angesehen wurde. Die Angiogenese wurde als Organisationsprinzip für die Arzneimittelforschung angesehen¹⁰. Daher ist die Konstruktion einer zuverlässigen und bequemen Methode zur Beurteilung des Ausmaßes der Angiogenese für die mechanische Forschung oder die Arzneimittelforschung bei Angiogenese-abhängigen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung.

Es wurden mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle entwickelt, um die Angiogenese^{zu bewerten 11}. Unter diesen können zweidimensionale (2-D) Modelle, wie der Matrix-Gel-Röhrchenbildungsassay¹², keine funktionellen röhrenförmigen Strukturen bilden. Die Tiermodelle, wie z. B. das Ischämie-Modell^der Hintergliedmaßen ^13,14, können den Angiogeneseprozess reproduzieren, sind jedoch komplex und erfordern ein Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem. 3D-Modelle der vaskulären Morphogenese, wie der Matrix-Gel-Plug-Assay, bieten eine einfache Plattform, die den Prozess der Angiogenese in vivo nachahmen ^{kann 15}, aber der Nachweis der Angiogenese erfordert Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung 16,17,18, die variabel und schlecht visualisiert sind.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay, bei dem Gefäßzellen mit Matrixgel gemischt und subkutan in den Rücken von Mäusen injiziert wurden, um einen Plug zu bilden. Im Pfropfen müssen Gefäßzellen die Matrix abbauen, sich vermehren, migrieren und sich selbst organisieren, um schließlich funktionsfähige Gefäße mit Blutfluss in der inneren Umgebung zu bilden. Danach wird fluoreszenzmarkiertes Dextran über die Schwanzvene injiziert, um durch den Pfropfen zu fließen, und die Markierung wird visualisiert, um Neogefäße anzuzeigen. Der Gehalt an Angiogenese kann quantitativ anhand der Länge der Gefäße bewertet werden. Diese Methode kann funktionelle Gefäße bilden, die in 2-D-Angiogenesemodellen¹² nicht hergestellt werden können, und erfordert keinen komplexen Färbeprozess wie bei gewöhnlichem Matrix-Gel-Plug-Assay¹¹. Es erfordert auch keine teuren spezifischen Instrumente wie das Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem bei der Ischämie der Hintergliedmaßen^Modell 13,14,19. Diese Methode ist vielseitig, kostengünstig, quantifizierbar und einfach durchzuführen und kann zur Bestimmung der pro- oder antiangiogenen Fähigkeit von Arzneimitteln oder in der mechanischen Forschung zur Angiogenese verwendet werden.

Protokoll

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Wenzhou Medical University genehmigt (XMSQ2021-0057, 19. Juli 2021). Alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Nährmediums

1. 10x M199-Nährmedium: M199-Pulver mit 90 ml deionisiertem Wasser auf 10-fache Konzentration auflösen und 10 ml fötales Kälberserum (FBS) hinzufügen, dann durch einen 0,22-μm-Filter passieren. Lagern Sie das Medium bis zu 2 Monate bei 4 °C.
2. Vollständiges Endothelkulturmedium: Fügen Sie 50 ml FBS, 5 ml Penicillin/Streptomycin und 5 ml Endothelzellwachstumsergänzung zu 460 ml Endothelzellmedium (ECM) hinzu. Lagern Sie das Medium bis zu 1 Monat bei 4 °C.

2. Vorbereitung der Gefäßzellen

1. Kultivierung von 1 x 10⁵ Gefäßzellen (primär kultivierte endotheliale Vorläuferzellen¹⁴, Endothelzellen oder Endothelzelllinien) mit 8 ml vollständigem Endothelkulturmedium in einer 100-mm-Gewebekulturschale bei 37 °C und 5 % CO_{2 bis} 70 % Konfluenz.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Schale 2x mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um nicht anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 3 ml 0,25% Trypsin mit 2,21 mM EDTA hinzu und inkubieren Sie es 1 Minute lang bei 37 °C.
3. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 7 ml vollständigem endothelialem Kulturmedium und spülen Sie die Zellen vorsichtig von der Kulturschale ab. Bestätigen Sie die Zellablösung unter einem Lichtmikroskop (40-fache Vergrößerung).
4. Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und 10 Minuten bei 400 x g zentrifugieren. Überstand entfernen und Zellen mit 5 ml vollständigem endothelialem Kulturmedium resuspendieren.
5. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und geben Sie die Suspension mit 2 x 10⁶ Zellen in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Jeder Stopfen enthält 1,5 x 10⁶ Zellen, zusätzliche 25% Zellen werden im Falle von Abfall verwendet. Jede Gruppe enthält mindestens 3 Stecker.
   HINWEIS: Nach Versuchen wurde festgestellt, dass 1,5 x 10⁶ Zellen in 300 μl Matrixgel zur ordnungsgemäßen Entwicklung der Angiogenese führten, und wurde daher für Experimente ausgewählt.
6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 x g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren, und entfernen Sie dann den Überstand.

3. Matrix-Gel-Vorbereitung

1. Sterile 1,5-ml-Röhrchen mit Zellpellets in einem 4 °C-Wasserbad vorkühlen. 30 g 1 ml Insulinspritzen in einem 4 °C-Kühlschrank vorkühlen.
2. Matrix-Gel in einem 4 °C warmen Wasserbad vollständig auftauen. Nicht mischen oder wirbeln. 10x M199 vorkühlen und Reagenz/Drug-of-Interest in einem 4 °C warmen Wasserbad testen.
3. Mischen Sie vorgekühltes Matrixgel mit 10x M199 mit 10% FBS und dem zu testenden Reagenz bei einem Volumenverhältnis von 8,8:1:0,2, um ein Matrixgel und eine M199-Mischung mit 1% FBS und dem Reagenz zu erhalten.
4. Resuspendieren Sie die Zellen mit 400 μl der Matrixgelmischung und mischen Sie sie vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Mäuse für die Injektion vorbereitet sind. Halten Sie die Matrix-Gel-Mischung die ganze Zeit auf Eis, um eine Gerinnung zu vermeiden.
   HINWEIS: Hier wurden 300 μl Matrixgelmischung mit 1,5 x 10⁶ Zellen verwendet, um einen Gelpfropfen zu bilden. Bereiten Sie 25% zusätzliches Gel entsprechend 25% zusätzlichen Zellen in Schritt 2 vor.

4. Vorbereitung der Maus

1. Betäuben Sie 6-8 Wochen alte männliche Nu/Nu-Maus (18-25 g) in der Kammer des Tieranästhesiegeräts mit Isofluran (3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min). Nach erfolgreicher Anästhesie, bestätigt durch das Fehlen von Aufrichtreflex und Zehenklemmreflex, bewegen Sie die Maus aus der Kammer, bewegen Sie die Maus aus der Kammer und setzen Sie eine Anästhesiemaske auf die Maus und ändern Sie die Isoflurankonzentration auf 1,5% in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min.
   HINWEIS: Bieten Sie dem Tier während des gesamten Vorgangs thermische Unterstützung mit einem Heizkissen.
2. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit zu vermeiden. Kleben Sie die Gliedmaßen der Mäuse in Bauchlage auf die Operationsplatine.

5. Injektion von Matrix-Gel-Gemischen

1. Laden Sie 300 μl der Matrixgelmischung in eine 1 ml Insulinspritze mit einer 30G-Nadel. Vermeiden Sie Blasenbildung. Laden Sie das Matrixgel schnell (innerhalb von 2 Minuten), um eine Verfestigung während dieser Zeit zu vermeiden. Legen Sie die mit Matrixgel beladene Insulinspritze sofort auf Eis.
2. Reinigen Sie die Haut auf dem Rücken von Mäusen mit 75%igen Alkoholpads. Injizieren Sie subkutan 300 μl Matrixgelmischung in eine Seite des Rückens von Mäusen.
3. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig von der Injektionsstelle, um ein Auslaufen der Matrixgelmischung zu verhindern. Achten Sie auf einen kleinen Buckel an der Injektionsstelle (Abbildung 1).
4. Legen Sie die Maus 2 Minuten lang auf das Heizkissen, damit die Matrix-Gel-Mischung gerinnen und einen Stopfen bilden kann.
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2. bis 5.4. , um einen Stecker auf der anderen Seite der Rückseite der Maus zu erstellen. Markieren Sie die Kanten der Höcker mit einem Filzstift.
6. Beobachten Sie die Maus, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Legen Sie die Maus in einen separaten Käfig, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Halten Sie die Mäuse im Versuchstierlabor der SPF-Klasse bei 22 ± 2 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus für 7 Tage.

6. Dextran-FITC-Injektion durch die Schwanzvene

1. Nach 7 Tagen Matrixgel-Injektion werden 0,5 mg Dextran-FITC mit 500 μl doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) resuspendiert und dann heftig vortexen, um die Dextran-FITC-Lösung mit der Endkonzentration von 1 μg/μl zu erhalten.
   HINWEIS: Verwenden Sie Dextran-FITC mit einem Molekulargewicht von ~150 kDa für den Angiogenese-Assay und verwenden Sie Dextran-FITC mit einem Molekulargewicht von ~4 kDa für den Gefäßpermeabilitätstest.
2. Laden Sie 50 μl Dextran-FITC-Lösung in die 29G-Spritzen.
3. Befestigen Sie die Maus am Schwanzvenen-Injektionsinstrument. Reinigen Sie den Schwanz mit einem Wattebausch mit 75 % Alkohol und injizieren Sie vorsichtig 50 μl Dextran-FITC durch die Schwanzvene.
4. Drücken Sie die Injektionsstelle 1 Minute lang mit einem Wattestäbchen zusammen, um die Blutung zu stillen, und setzen Sie die Mäuse dann für 30 Minuten wieder in den Käfig.
5. Wiederholen Sie die Schritte 6.3. und 6.4. bis alle Mäuse eine Dextran-FITC-Injektion erhalten haben.

7. Matrix-Gel-Plug-Kollektion

1. Intraperitoneal injizieren Sie 1% Pentobarbital-Natrium in PBS (200 mg/kg Körpergewicht) und euthanasieren Sie die Mäuse mit einem von der IACUC zugelassenen Verfahren.
2. Schneiden Sie die Haut entlang des markierten Randes des Plugs mit einer chirurgischen Schere ab und entfernen Sie die Haut über dem Matrix-Gel-Plug.
3. Sammeln Sie den Stopfen und spülen Sie ihn in einem kleinen Becherglas mit 1x PBS aus, um überschüssiges Blut abzuwaschen (Abbildung 2A). Die Farbe des Pfropfens kann grob den Grad der Bluthäufigkeit und den Inhalt der Neogefäße beschreiben (Abbildung 3A).

8. Einbettung des Matrix-Gel-Plugs und Schnittvorbereitung

1. Decken Sie den Knopf der Gewebeeinbettungskassette mit etwa 0,5 ml Gewebeeinbettungsgel ab und setzen Sie dann sofort den Matrix-Gel-Stopfen in der gewünschten Ausrichtung auf das Gewebeeinbettgel, wie in Abbildung 2B gezeigt. Betten Sie dann den Plug mit zusätzlichem Gewebeeinbettungsgel ein.
2. Legen Sie die Kassetten für 12 h in einen -80 °C Gefrierschrank, damit sie fest werden.
3. Für die Dickschliffpräparation nehmen Sie den erstarrten Pfropfenblock heraus und schneiden Sie mit dem Gefriermikrotom gemäß der Anleitung 12 μm dicke Schnitte und montieren Sie sie auf Objektträger.
4. Schneiden Sie 5-10 Abschnitte von jedem Steckblock ab.

9. Quantifizierung der Angiogenese (Abbildung 3)

1. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder von 5 unabhängigen Feldern des Schnitts mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm Wellenlänge unter 10-facher Vergrößerung.
2. Öffnen Sie die Bilddatei mit der Image J-Software (https://imagej.en.softonic.com/) und klicken Sie auf die Schaltfläche Angiogenese-Analyse . Klicken Sie dann auf die Schaltfläche HUVEC-Phasenkontrast analysieren und wechseln Sie zur Tabelle der Statistikergebnisse , um Informationen zu sammeln. Messen Sie alle 5 aufgenommenen Fluoreszenzbilder für jeden Abschnitt.
3. Analysieren Sie die Gesamtlänge der Neogefäße aus verschiedenen Gruppen, um den Unterschied in der Angiogenese zwischen diesen Gruppen statistisch zu bewerten.
   HINWEIS: Die Gesamtlänge der Mastersegmente gibt die Gesamtlänge von Neo-Schiffen an. Das Reagenz, das die Länge der Neogefäße erhöht, wird als pro-angiogen bezeichnet, während das Reagenz, das die Länge der Neogefäße verringert, anti-angiogen ist.

10. Quantifizierung der Gefäßpermeabilität (Abbildung 4)

1. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder aus 5 unabhängigen Feldern des Schnitts mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm Wellenlänge unter 20-facher Vergrößerung.
2. Öffnen Sie die Image-Datei mit der Image J-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Freihandauswahl und kreisen Sie den Leckagebereich ein, klicken Sie dann auf das Menü Analysieren und wählen Sie die Option Messen , um die Flächeninformationen des Leckagebereichs zu erhalten. Verwenden Sie das Verhältnis von Leckagefläche und Bildbereich, um die Gefäßpermeabilität anzuzeigen.
3. Analysieren Sie das Verhältnis von Leckagefläche und Bildfläche aus verschiedenen Gruppen, um den Unterschied in der Gefäßpermeabilität zwischen diesen Gruppen statistisch zu bewerten.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das Flussdiagramm, wie die Mischung aus Matrixgel, Gefäßzellen, Kulturmedium und Reagenz hergestellt wird. Die Mischung wurde dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert und mit einem Heizkissen erhitzt, um die Gerinnung zu beschleunigen und schließlich einen Gelpfropfen zu bilden.

Abbildung 2A ist das Flussdiagramm zur Anzeige von Gefäßen mit fluoreszenzmarkiertem Dextran. Fluoreszenzmarkiertes Dex...

Diskussion

Wir präsentieren eine zuverlässige und komfortable Methode zur quantitativen Bewertung der Angiogenese in vivo ohne Färbung. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert, um einen Gelpfropfen zu bilden (Abbildung 1). Nach 7 Tagen Gelpfropfenbildung wurde Dextran-FITC intravenös injiziert und 30 Minuten lang zirkuliert. Der Gelpfropfen wu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF