Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Zusammenfassung

Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Es wurden mehrere Modelle entwickelt, um die Angiogenese in vivo zu untersuchen. Die meisten dieser Modelle sind jedoch komplex und teuer, erfordern spezielle Geräte oder sind für die anschließende quantitative Analyse schwer durchzuführen. Hier präsentieren wir einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay zur Bewertung der Angiogenese in vivo. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken der Empfängermäuse injiziert. Nach 7 Tagen wird Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, die Dextran-FITC enthält, über die Schwanzvene injiziert und 30 Minuten lang in den Gefäßen zirkuliert. Matrix-Gel-Plugs werden gesammelt und mit Gewebeeinbettungsgel eingebettet, dann werden 12-μm-Abschnitte für die Fluoreszenzdetektion ohne Färbung geschnitten. In diesem Assay kann Dextran-FITC mit hohem Molekulargewicht (~150.000 Da) verwendet werden, um funktionelle Gefäße zum Nachweis ihrer Länge anzuzeigen, während Dextran-FITC mit niedrigem Molekulargewicht (~4.400 Da) verwendet werden kann, um die Permeabilität von Neogefäßen anzuzeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine zuverlässige und bequeme Methode für die quantitative Untersuchung der Angiogenese in vivo bieten kann.

Einleitung

Die Angiogenese, der Prozess der Bildung von Neogefäßen aus bereits bestehenden Gefäßen, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Embryonalentwicklung, Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorentwicklung usw.1,2,3,4,5. Dieser dynamische Prozess umfasst mehrere Schritte, darunter den Abbau der Matrix, die Proliferation von Gefäßzellen, die Migration und Selbstorganisation zu röhrenförmigen Strukturen sowie die Stabilisierung der Neogefäße⁶....

Protokoll

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Wenzhou Medical University genehmigt (XMSQ2021-0057, 19. Juli 2021). Alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Nährmediums

1. 10x M199-Nährmedium: M199-Pulver mit 90 ml deionisiertem Wasser auf 10-fache Konzentration auflösen und 10 ml fötales Kälberserum (FBS) hinzufügen, dann durch einen 0,22-μm-Filter passieren. Lagern Sie das Medium bis zu 2 Monate bei 4 °C.
2. Vollständiges Endothelkulturmedium: Fügen Sie 50 ml FB....

Diskussion

Wir präsentieren eine zuverlässige und komfortable Methode zur quantitativen Bewertung der Angiogenese in vivo ohne Färbung. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert, um einen Gelpfropfen zu bilden (Abbildung 1). Nach 7 Tagen Gelpfropfenbildung wurde Dextran-FITC intravenös injiziert und 30 Minuten lang zirkuliert. Der Gelpfropfen wu.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF