Essai de bouchon de gel matriciel in vivo modifié pour les études d’angiogenèse

Résumé

La méthode présentée ici permet d’évaluer l’effet des réactifs sur l’angiogenèse ou la perméabilité vasculaire in vivo sans coloration. La méthode utilise l’injection de dextran-FITC via la veine de la queue pour visualiser les néo-vaisseaux ou les fuites vasculaires.

Résumé

Plusieurs modèles ont été développés pour étudier l’angiogenèse in vivo. Cependant, la plupart de ces modèles sont complexes et coûteux, nécessitent un équipement spécialisé ou sont difficiles à réaliser pour une analyse quantitative ultérieure. Nous présentons ici un test de bouchon de gel matriciel modifié pour évaluer l’angiogenèse in vivo. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence ou en l’absence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris receveuses. Après 7 jours, une solution saline tampon phosphate contenant du dextran-FITC est injectée par la veine de la queue et circule dans des vaisseaux pendant 30 min. Des bouchons de gel matriciel sont collectés et intégrés dans du gel d’enrobage tissulaire, puis des sections de 12 μm sont découpées pour la détection par fluorescence sans coloration. Dans ce test, le dextran-FITC de haut poids moléculaire (~150 000 Da) peut être utilisé pour indiquer les vaisseaux fonctionnels pour détecter leur longueur, tandis que le dextran-FITC de faible poids moléculaire (~4 400 Da) peut être utilisé pour indiquer la perméabilité des néo-vaisseaux. En conclusion, ce protocole peut fournir une méthode fiable et pratique pour l’étude quantitative de l’angiogenèse in vivo.

Introduction

L’angiogenèse, le processus de formation de néo-vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, l’athérosclérose, le développement tumoral, etc.1,2,3,4,5. Ce processus dynamique implique plusieurs étapes, dont la dégradation de la matrice, la prolifération des cellules vasculaires, la migration et l’auto-organisation pour former des structures tubulaires et la stabilisation des néo-vaisseaux⁶. Il a été démontré que la promotion de l’angiogenèse est essentielle dans le traitement de l’infarctus du myocarde, des accidents vasculaires cérébraux et d’autres types de maladies ischémiques⁷, tandis que l’inhibition de l’angiogenèse a été considérée comme une stratégie prometteuse dans le traitement des cancers⁸ et des maladies rhumatoïdes⁹. L’angiogenèse a été considérée comme un principe organisateur de la découverte de médicaments¹⁰. Ainsi, la construction d’une méthode fiable et pratique pour évaluer l’étendue de l’angiogenèse est essentielle pour la recherche mécanique ou la découverte de médicaments dans les maladies dépendantes de l’angiogenèse.

Plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été développés pour évaluer l’angiogenèse¹¹. Parmi ceux-ci, les modèles bidimensionnels (2D), comme le test de formation de tubes de gel^{matriciel 12}, ne peuvent pas former de structures tubulaires fonctionnelles. Les modèles animaux, tels que le modèle d’ischémie des membres postérieurs^13,14, peuvent reproduire le processus d’angiogenèse mais sont complexes et nécessitent un système d’imagerie du flux sanguin par chatoiement laser. Les modèles 3D de morphogenèse vasculaire, comme le test du bouchon de gel matriciel, fournissent une plate-forme simple qui peut imiter le processus d’angiogenèse in vivo¹⁵, mais la détection de l’angiogenèse nécessite une immunohistochimie ou une coloration par immunofluorescence 16,17,18, qui sont variables et mal visualisées.

Ici, nous décrivons un protocole pour un test de bouchon de gel matriciel modifié où les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel et injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris pour former un bouchon. Dans le bouchon, les cellules vasculaires doivent dégrader la matrice, proliférer, migrer et s’auto-organiser pour finalement former des vaisseaux fonctionnels avec un flux sanguin dans l’environnement interne. Par la suite, du dextran fluorescent est injecté par la veine de la queue, pour s’écouler à travers le bouchon, et l’étiquette est visualisée pour indiquer les néo-vaisseaux. Le contenu de l’angiogenèse peut être évalué quantitativement par la longueur des vaisseaux. Cette méthode peut former des vaisseaux fonctionnels qui ne peuvent pas être produits dans les modèles d’angiogenèse 2D¹², et ne nécessite pas de processus de coloration complexe comme dans le test ordinaire de bouchon de gel^{matriciel 11}. Il ne nécessite pas non plus d’instruments spécifiques coûteux comme le système d’imagerie du flux sanguin par chatoiement laser dans l’ischémie des membres postérieurs modèle 13,14,19. Cette méthode est polyvalente, peu coûteuse, quantifiable et facile à réaliser, et peut être utilisée pour déterminer la capacité pro- ou anti-angiogénique des médicaments ou être utilisée dans la recherche mécanique impliquée dans l’angiogenèse.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université médicale de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19^juillet 2021). Tous les réactifs et consommables sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation du milieu de culture

1. 10 milieux de culture M199 : Dissoudre la poudre M199 à une concentration 10x avec 90 mL d’eau désionisée et ajouter 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS), puis passer à travers un filtre de 0,22 μm. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 2 mois.
2. Milieu de culture endothélial complet : Ajouter 50 mL de FBS, 5 mL de pénicilline/streptomycine et 5 mL de supplément de croissance des cellules endothéliales à 460 mL de milieu de cellules endothéliales (MEC). Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 1 mois.

2. Préparation des cellules vasculaires

1. Cultiver 1 x 10⁵ cellules vasculaires (cellules progénitrices endothéliales primaires^{cultivées 14}, cellules endothéliales ou lignées cellulaires endothéliales) avec 8 mL de milieu de culture endothélial complet dans une boîte de culture tissulaire de 100 mm à 37 °C et 5 % de CO₂ à 70 % de confluence.
2. Retirez le milieu de culture et rincez la boîte 2 fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules non attachées et les débris. Retirer le PBS et ajouter 3 mL de trypsine à 0,25 % contenant 2,21 mM d’EDTA, et incuber à 37 °C pendant 1 min.
3. Neutraliser la trypsine avec 7 ml de milieu de culture endothélial complet et rincer délicatement les cellules de la boîte de culture. Confirmez le décollement cellulaire au microscope optique (grossissement de 40x).
4. Prélever la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 10 min. Retirer les cellules surnageantes et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu de culture endothélial complet.
5. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et déplacer la suspension contenant 2 x 10⁶ cellules dans un tube stérile de 1,5 ml. Chaque bouchon contient 1,5 x 10⁶ cellules, 25% de cellules supplémentaires sont utilisées en cas de gaspillage. Chaque groupe comprend au moins 3 prises.
   NOTE : Après des essais, il a été constaté que 1,5 x 10⁶ cellules dans 300 μL de gel matriciel conduisaient au développement correct de l’angiogenèse et ont donc été choisies pour l’expérimentation.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min pour granuler les cellules, puis éliminer le surnageant.

3. Préparation du gel matriciel

1. Pré-refroidir des tubes stériles de 1,5 mL contenant des pastilles de cellules dans un bain-marie à 4 °C. Pré-refroidir les seringues à insuline de 30 G et 1 mL dans un réfrigérateur à 4 °C.
2. Décongeler complètement le gel matriciel au bain-marie à 4 °C. Ne pas mélanger ou vortex. Pré-refroidissez 10x M199 et testez le réactif/médicament d’intérêt dans un bain-marie à 4 °C.
3. Mélanger un gel matriciel pré-refroidi avec 10x M199 contenant 10% de FBS et le réactif à tester à un rapport volumique de 8,8:1:0,2 pour obtenir un gel matriciel et un mélange M199 contenant 1% de FBS et le réactif.
4. Remettre en suspension les cellules avec 400 μL du mélange de gel matriciel, mélanger doucement pour éviter la formation de bulles. Gardez le tube sur de la glace jusqu’à ce que les souris soient prêtes pour l’injection. Gardez le mélange de gel matriciel sur de la glace tout le temps pour éviter la coagulation.
   REMARQUE : Ici, 300 μL de mélange de gel matriciel contenant 1,5 x 10⁶ cellules ont été utilisés pour former un bouchon de gel. Préparez 25 % de gel supplémentaire selon 25 % de cellules supplémentaires à l’étape 2.

4. Préparation de la souris

1. Anesthésier une souris Nu/Nu mâle de 6 à 8 semaines (18 à 25 g) dans la chambre de l’appareil d’anesthésie animale avec de l’isoflurane (3 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min). Après une anesthésie réussie, confirmée par l’absence de réflexe de redressement et de réflexe de pincement des orteils, sortir la souris de la chambre, sortir la souris de la chambre et mettre un masque d’anesthésie sur la souris et modifier la concentration d’isoflurane à 1,5 % dans 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min.
   REMARQUE : Fournir un soutien thermique à l’animal à l’aide d’un coussin chauffant tout au long de la procédure.
2. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Collez les membres des souris sur le tableau d’opération en position couchée.

5. Injection de mélange de gel matriciel

1. Chargez 300 μL du mélange de gel matriciel dans une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 30 G. Évitez la formation de bulles. Chargez rapidement le gel matriciel (dans les 2 minutes) pour éviter la solidification pendant ce temps. Placez immédiatement la seringue à insuline chargée de gel matriciel sur de la glace.
2. Nettoyez la peau du dos des souris à l’aide de tampons d’alcool à 75 %. Injecter par voie sous-cutanée 300 μL de mélange de gel matriciel dans un côté du dos des souris.
3. Retirez délicatement l’aiguille du site d’injection pour éviter toute fuite du mélange de gel matriciel. Vérifiez s’il y a une petite bosse au site d’injection (figure 1).
4. Placez la souris sur le coussin chauffant pendant 2 min pour laisser le mélange de gel matriciel coaguler et former un bouchon.
5. Répétez les étapes 5.2. à 5.4. pour créer une prise de l’autre côté de l’arrière de la souris. Marquez les bords des bosses à l’aide d’un marqueur.
6. Observez la souris jusqu’à ce qu’elle ait repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Mettez la souris dans une cage séparée jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée. Hébergez les souris dans un laboratoire d’animaux de laboratoire de classe SPF à 22 ± 2 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures pendant 7 jours.

6. Injection de Dextran-FITC par la veine de la queue

1. Après 7 jours d’injection de gel matriciel, remettre en suspension 0,5 mg de dextran-FITC avec 500 μL d’eau doublement distillée (ddH₂O) puis agiter violemment pour obtenir la solution de dextran-FITC à la concentration finale de 1 μg/μL.
   REMARQUE : Utilisez le dextran-FITC avec une masse moléculaire de ~150 kDa pour le test d’angiogenèse, et utilisez le dextran-FITC avec une masse moléculaire de ~4 kDa pour le test de perméabilité vasculaire.
2. Chargez 50 μL de solution de dextran-FITC dans les seringues 29G.
3. Fixez la souris sur l’instrument d’injection de la veine caudale. Nettoyez la queue avec une boule de coton à 75 % d’alcool et injectez doucement 50 μL de dextran-FITC par la veine de la queue.
4. Comprimez le site d’injection avec un coton-tige pendant 1 min pour arrêter le saignement, puis remettez les souris dans la cage pendant 30 min.
5. Répétez les étapes 6.3. et 6.4. jusqu’à ce que toutes les souris aient reçu une injection de dextran-FITC.

7. Collection de bouchons de gel matriciels

1. Injecter par voie intrapéritonéale 1 % de pentobarbital sodique dans du PBS (200 mg/kg de poids corporel) et euthanasier les souris selon une procédure approuvée par l’IACUC.
2. Coupez la peau le long du bord marqué du bouchon à l’aide de ciseaux chirurgicaux et retirez la peau au-dessus du bouchon de gel matriciel.
3. Récupérez le bouchon et rincez-le dans un petit bécher avec 1x PBS pour éliminer l’excès de sang (Figure 2A). La couleur du bouchon peut délimiter approximativement le degré d’abondance du sang et le contenu des néo-vaisseaux (Figure 3A).

8. Enrobage de la matrice de la fiche de gel et préparation de la section

1. Couvrez le bouton de la cassette d’enrobage tissulaire avec environ 0,5 mL de gel d’enrobage tissulaire, puis placez immédiatement le bouchon de gel matriciel sur le gel d’enrobage tissulaire dans l’orientation souhaitée, comme indiqué à la figure 2B. Ensuite, intégrez le bouchon avec du gel d’enrobage de tissu supplémentaire.
2. Mettez les cassettes au congélateur à -80 °C pendant 12 h pour qu’elles se solidifient.
3. Pour la préparation de coupes épaisses, retirez le bloc de bouchon solidifié et coupez des sections de 12 μm d’épaisseur à l’aide du microtome de congélation selon les instructions, puis montez sur des lames de microscope.
4. Coupez 5 à 10 sections de chaque bloc de bouchons.

9. Quantification de l’angiogenèse (Figure 3)

1. Acquérir des images de fluorescence à partir de 5 champs indépendants de la coupe avec un microscope à fluorescence inversée à une longueur d’onde de 488 nm sous un grossissement de 10x.
2. Ouvrez le fichier image avec le logiciel Image J (https://imagej.en.softonic.com/) et cliquez sur le bouton Analyser l’angiogenèse . Ensuite, cliquez sur le bouton Analyser le contraste de phase HUVEC et passez au tableau des résultats des statistiques pour recueillir des informations. Mesurez les 5 images de fluorescence acquises pour chaque section.
3. Analyser la longueur totale des néo-vaisseaux de différents groupes pour évaluer statistiquement la différence d’angiogenèse entre ces groupes.
   NOTA : La longueur totale des segments maîtres indique la longueur totale des néo-navires. Le réactif qui augmente la longueur des néo-vaisseaux est appelé pro-angiogénique, tandis que le réactif qui diminue la longueur des néo-vaisseaux est anti-angiogénique.

10. Quantification de la perméabilité vasculaire (Figure 4)

1. Acquérir des images de fluorescence à partir de 5 champs indépendants de la coupe avec un microscope à fluorescence inversée à une longueur d’onde de 488 nm sous un grossissement de 20x.
2. Ouvrez le fichier image avec le logiciel Image J. Cliquez sur le bouton Sélection à main levée et encerclez la zone de fuite, puis cliquez sur le menu Analyser et sélectionnez l’option Mesurer pour obtenir les informations sur la zone de fuite. Utilisez le rapport entre la zone de fuite et la zone de l’image pour indiquer la perméabilité vasculaire.
3. Analyser le rapport entre la zone de fuite et la surface de l’image de différents groupes pour évaluer statistiquement la différence de perméabilité vasculaire entre ces groupes.

Résultats

La figure 1 est l’organigramme illustrant comment préparer le mélange de gel matriciel, de cellules vasculaires, de milieu de culture et de réactif. Le mélange a ensuite été injecté par voie sous-cutanée dans le dos de souris Nu/Nu et chauffé à l’aide d’un coussin chauffant pour accélérer sa coagulation et finalement former un bouchon de gel.

La figure 2A est l’organigramme permettant d’indiquer les récipients c...

Discussion

Nous présentons une méthode fiable et pratique pour l’évaluation quantitative de l’angiogenèse in vivo sans coloration. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris Nu/Nu pour former un bouchon de gel (Figure 1). Après 7 jours de formation d’un bouchon de gel, le dextran-FITC a été injecté par voie in...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF