Essai de bouchon de gel matriciel in vivo modifié pour les études d’angiogenèse

Résumé

La méthode présentée ici permet d’évaluer l’effet des réactifs sur l’angiogenèse ou la perméabilité vasculaire in vivo sans coloration. La méthode utilise l’injection de dextran-FITC via la veine de la queue pour visualiser les néo-vaisseaux ou les fuites vasculaires.

Résumé

Plusieurs modèles ont été développés pour étudier l’angiogenèse in vivo. Cependant, la plupart de ces modèles sont complexes et coûteux, nécessitent un équipement spécialisé ou sont difficiles à réaliser pour une analyse quantitative ultérieure. Nous présentons ici un test de bouchon de gel matriciel modifié pour évaluer l’angiogenèse in vivo. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence ou en l’absence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris receveuses. Après 7 jours, une solution saline tampon phosphate contenant du dextran-FITC est injectée par la veine de la queue et circule dans des vaisseaux pendant 30 min. Des bouchons de gel matriciel sont collectés et intégrés dans du gel d’enrobage tissulaire, puis des sections de 12 μm sont découpées pour la détection par fluorescence sans coloration. Dans ce test, le dextran-FITC de haut poids moléculaire (~150 000 Da) peut être utilisé pour indiquer les vaisseaux fonctionnels pour détecter leur longueur, tandis que le dextran-FITC de faible poids moléculaire (~4 400 Da) peut être utilisé pour indiquer la perméabilité des néo-vaisseaux. En conclusion, ce protocole peut fournir une méthode fiable et pratique pour l’étude quantitative de l’angiogenèse in vivo.

Introduction

L’angiogenèse, le processus de formation de néo-vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, l’athérosclérose, le développement tumoral, etc.1,2,3,4,5. Ce processus dynamique implique plusieurs étapes, dont la dégradation de la matrice, la prolifération des cellules vasculaires, la migration et l’auto-organisation pour former des structures tubulaires et la....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université médicale de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19^juillet 2021). Tous les réactifs et consommables sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation du milieu de culture

1. 10 milieux de culture M199 : Dissoudre la poudre M199 à une concentration 10x avec 90 mL d’eau désionisée et ajouter 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS), puis passer à travers un filtre de 0,22 μm. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 2 mois.
2. Milieu de cultu....

Discussion

Nous présentons une méthode fiable et pratique pour l’évaluation quantitative de l’angiogenèse in vivo sans coloration. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris Nu/Nu pour former un bouchon de gel (Figure 1). Après 7 jours de formation d’un bouchon de gel, le dextran-FITC a été injecté par voie in.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF