혈관신생 연구를 위한 수정된 In Vivo Matrix Gel Plug Assay

요약

여기에 제시된 방법은 염색 없이 생체 내에서 혈관신생 또는 혈관 투과성에 대한 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입을 사용하여 신생 혈관 또는 혈관 누출을 시각화합니다.

초록

생체 내 혈관 신생을 조사하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 그러나 이러한 모델의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 들거나 특수 장비가 필요하거나 후속 정량 분석을 위해 수행하기 어렵습니다. 여기서는 생체 내 혈관신생을 평가하기 위해 수정된 매트릭스 겔 플러그 분석을 제시합니다. 이 프로토콜에서, 혈관 세포를 pro-angiogenic 또는 anti-angiogenic 시약의 존재 또는 부재 하에서 매트릭스 겔과 혼합한 후, 수용 마우스의 등에 피하 주사하였다. 7일 후, 덱스트란-FITC를 함유한 인산염 완충 식염수를 꼬리정맥을 통해 주입하여 30분 동안 혈관 내에서 순환시킵니다. 매트릭스 겔 플러그를 채취하여 조직 포매 겔로 포매한 다음 염색 없이 형광 검출을 위해 12μm 절편을 절단합니다. 이 분석에서 고분자량(~150,000Da)의 dextran-FITC는 길이를 검출하기 위한 기능성 용기를 나타내는 데 사용할 수 있으며, 저분자량(~4,400Da)의 dextran-FITC는 신생 혈관의 투과성을 나타내는 데 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 생체 내 혈관신생의 정량적 연구를 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법을 제공할 수 있습니다.

서문

기존 혈관에서 신생 혈관을 형성하는 과정인 혈관신생은 배아 발달, 상처 치유, 죽상동맥경화증, 종양 발달 등과 같은 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.1,2,3,4,5. 이 역동적인 과정에는 매트릭스의 분해, 혈관 세포 증식, 관 구조를 형성하기 위한 이동 및 자기 조직화, 신생 혈관의 안정화⁶ 등 여러 단계가 포함된다. 혈관신생을 촉진하는 것은 심근경색, 뇌졸중 및 기타 허혈성 질환7의 치료에 중요한 것으로 입증^{되었으며, 혈관}신생을 억제하는 것은 암⁸ 및 류마티스 질환⁹의 치료에 있어 유망한 전략으로 간주되어 왔다. 혈관신생은 신약 개발의 조직 원리로 간주되어 왔다¹⁰. 따라서, 혈관신생의 정도를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법의 구축은 혈관신생 의존성 질환의 기계적 연구 또는 약물 발견에 매우 중요합니다.

혈관신생을 평가하기 위해 여러 in vitro 및 in vivo 모델이 개발되었다¹¹. 이 중에서, 매트릭스 겔 튜브 형성 분석(¹²)과 같은 2차원(2-D) 모델은 기능적 관형 구조를 형성할 수 없다. 뒷다리 허혈 모델^(13,14)과 같은 동물 모델은 혈관신생 과정을 재현할 수 있지만, 복잡하고 레이저 스페클 혈류 이미징 시스템을 필요로 한다. 매트릭스 겔 플러그 분석과 같은 혈관 형태 형성의 3D 모델은 생체 내 혈관 신생 과정을 모방할 수 있는 간단한 플랫폼을 제공하지만(¹⁵), 혈관 신생을 검출하려면 면역조직화학 또는 면역형광 염색^(16,17,18)이 필요하며, 이는 가변적이고 잘 시각화되지 않습니다.

여기에서, 우리는 혈관 세포를 매트릭스 겔과 혼합하고 마우스의 뒤쪽에 피하 주사하여 플러그를 형성하는 변형된 매트릭스 겔 플러그 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 플러그에서 혈관 세포는 기질을 분해하고, 증식하고, 이동하고, 자기 조직화하여 최종적으로 내부 환경에서 혈류가 흐르는 기능적인 혈관을 형성해야 합니다. 그 후, 형광 표지 덱스트란이 꼬리 정맥을 통해 주입되어 플러그를 통해 흐르고 라벨을 시각화하여 신생 혈관을 나타냅니다. 혈관신생의 함량은 혈관의 길이에 의해 정량적으로 평가될 수 있다. 이 방법은 2-D 혈관신생 모델⁽¹²)에서 생산될 수 없는 기능성 용기를 형성할 수 있고, 일반적인 매트릭스 겔 플러그 분석법⁽¹¹)에서와 같이 복잡한 염색 과정을 필요로 하지 않는다. 또한 뒷다리 허혈 모델 13,14,19의 레이저 스페클 혈류 영상 시스템과 같은 값비싼 특정 기기가 필요하지 않습니다. 이 방법은 다재다능하고 비용이 저렴하며 정량화가 가능하고 수행하기 쉬우며 약물의 사전 또는 항 혈관 신생 능력을 결정하는 데 사용하거나 혈관 신생과 관련된 기계적 연구에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 피험자와 관련된 모든 절차는 원저우 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(XMSQ2021-0057, 2021년 7월 19^일). 모든 시약과 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 배양 배지 준비

1. 10x M199 배양 배지: M199 분말을 탈이온수 90mL로 10배 농도로 용해하고 소 태아 혈청(FBS) 10mL를 첨가한 다음 0.22μm 필터를 통과시킵니다. 배지를 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다.
2. 완전한 내피 배양 배지: 460mL의 내피 세포 배지(ECM)에 FBS 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 5mL, 내피 세포 성장 보충제 5mL를 추가합니다. 배지를 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.

2. 혈관 세포 준비

1. 1 x 10⁵ 혈관 세포(1차 배양 내피 전구 세포¹⁴, 내피 세포 또는 내피 세포주)를 37°C 및 5% CO₂ - 70% 밀도에서 100mm 조직 배양 접시에 8mL의 완전한 내피 배양 배지로 배양합니다.
2. 배양 배지를 제거하고 접시를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 2배 헹구어 부착되지 않은 세포와 부스러기를 제거합니다. PBS를 제거하고 2.21mM EDTA를 함유하는 0.25% 트립신 3mL를 첨가하고 37°C에서 1분 동안 배양합니다.
3. 7mL의 완전한 내피 배양 배지로 트립신을 중화하고 배양 접시에서 세포를 부드럽게 헹굽니다. 광학 현미경(40배 확대)으로 세포 분리를 확인합니다.
4. 15mL 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 400 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 5mL의 완전한 내피 배양 배지로 세포를 재현탁시킵니다.
5. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산하고 2 x 10⁶ 세포가 들어 있는 현탁액을 멸균 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 각 플러그에는 1.5 x 10⁶ 셀이 포함되어 있으며 낭비 시 추가 25% 셀이 사용됩니다. 각 그룹에는 최소 3개의 플러그가 포함되어 있습니다.
   참고: 시험 후 300μL의 매트릭스 겔에 포함된 1.5 x 10⁶ 세포가 혈관 신생의 적절한 발달을 유도하여 실험을 위해 선택되었음을 발견했습니다.
6. 400 x g 에서 세포 현탁액을 펠릿 세포에 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.

3. 매트릭스 겔 준비

1. 세포 펠릿이 들어 있는 멸균 1.5mL 튜브를 4°C 수조에서 사전 냉각합니다. 30G 1mL 인슐린 주사기를 4°C 냉장고에서 사전 냉각합니다.
2. 매트릭스 젤을 4°C 수조에서 완전히 해동합니다. 혼합하거나 소용돌이치지 마십시오. 10x M199를 사전 냉각하고 4°C 수조에서 시약/관심 약물을 테스트합니다.
3. 사전 냉각된 매트릭스 겔을 10% FBS가 포함된 199x M10 및 8.8:1:0.2의 부피 비율로 테스트할 시약을 혼합하여 1% FBS와 시약을 포함하는 매트릭스 겔과 M199 혼합물을 얻습니다.
4. 400 μL의 매트릭스 겔 혼합물로 세포를 재현탁시키고 기포가 형성되지 않도록 부드럽게 혼합합니다. 쥐가 주사할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 응고를 피하기 위해 매트릭스 젤 혼합물을 항상 얼음 위에 두십시오.
   참고: 여기서, 1.5 x 10⁶ 세포를 포함하는 300 μL의 매트릭스 겔 혼합물을 사용하여 겔 플러그를 형성하였다. 2단계에서 25% 추가 세포에 따라 25% 추가 겔을 준비합니다.

4. 마우스 준비

1. 동물 마취 장치의 챔버에서 6-8주 된 수컷 Nu/Nu 마우스(18-25g)를 이소플루란(1L/min의 유속으로 100% 산소의 3% 이소플루란)으로 마취합니다. 마취에 성공한 후, 직정 반사 및 발가락 꼬집 반사가 없는 것으로 확인된 후, 마우스를 챔버 밖으로 옮기고, 마우스를 챔버 밖으로 이동하고, 마우스에 마취 마스크를 씌우고, 1L/min의 유속으로 100% 산소에서 이소플루란의 농도를 1.5%로 변경합니다.
   알림: 절차 내내 가열 패드를 사용하여 동물에게 열 지원을 제공하십시오.
2. 건조함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용하십시오. 엎드린 자세로 수술 보드에 쥐의 팔다리를 테이프로 붙입니다.

5. 매트릭스 겔 혼합물 주입

1. 매트릭스 겔 혼합물 300μL를 30G 바늘이 있는 1mL 인슐린 주사기에 넣습니다. 기포 형성을 피하십시오. 이 시간 동안 응고를 방지하기 위해 매트릭스 겔을 빠르게 로드합니다(2분 이내). 매트릭스 젤이 장전된 인슐린 주사기를 즉시 얼음 위에 놓습니다.
2. 75% 알코올 패드를 사용하여 쥐 등의 피부를 청소합니다. 300μL의 매트릭스 겔 혼합물을 마우스 등의 한쪽 면에 피하 주사합니다.
3. 매트릭스 겔 혼합물의 누출을 방지하기 위해 주사 부위에서 바늘을 부드럽게 제거합니다. 주입 부위에 작은 혹이 있는지 확인합니다(그림 1).
4. 마우스를 가열 패드에 2분 동안 올려 매트릭스 젤 혼합물이 응고되어 플러그를 형성하도록 합니다.
5. 5.2단계를 반복합니다. 을 5.4로 설정합니다. 마우스 뒷면의 반대쪽에 플러그를 만듭니다. 마커 펜을 사용하여 혹의 가장자리를 표시하십시오.
6. 쥐가 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 되찾을 때까지 관찰하십시오. 마우스가 완전히 복구될 때까지 별도의 케이지에 넣습니다. 생쥐를 22 ± 2°C의 SPF 등급 실험 동물 실험실에서 7일 동안 12시간 명암주기로 보관합니다.

6. 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입

1. 매트릭스 겔 주입 7일 후, 0.5mg의 덱스트란-FITC 500μL의 이중 증류수(ddH₂O)를 재현탁시킨 다음 격렬하게 소용돌이쳐 최종 농도 1μg/μL의 덱스트란-FITC 용액을 얻습니다.
   참고: 혈관신생 분석에는 분자량이 ~150kDa인 dextran-FITC를 사용하고 혈관 투과성 분석에는 분자량이 ~4kDa인 dextran-FITC를 사용합니다.
2. 50μL의 덱스트란-FITC 용액을 29G 주사기에 넣습니다.
3. 꼬리 정맥 주사기에 마우스를 고정합니다. 알코올 75% 화장솜으로 꼬리를 닦고 꼬리 정맥을 통해 50μL의 덱스트란-FITC를 부드럽게 주입합니다.
4. 면봉으로 주사 부위를 1분 동안 압박하여 출혈을 가라앉힌 다음 쥐를 다시 케이지에 넣고 30분 동안 넣습니다.
5. 6.3단계를 반복합니다. 및 6.4. 모든 마우스가 덱스트란-FITC 주사를 맞을 때까지.

7. 매트릭스 젤 플러그 수집

1. PBS(체중 200mg/kg)에 1% 펜토바르비탈 나트륨을 복강내로 주입하고 IACUC 승인 절차로 마우스를 안락사시킵니다.
2. 수술용 가위를 사용하여 플러그의 표시된 경계를 따라 피부를 자르고 매트릭스 젤 플러그 위의 피부를 제거합니다.
3. 플러그를 모으고 1x PBS로 작은 비커를 헹구어 과도한 혈액을 씻어냅니다(그림 2A). 플러그의 색상은 혈액 풍부도의 정도와 신생 혈관의 함량을 대략적으로 나타낼 수 있습니다(그림 3A).

8. 매트릭스 젤 플러그 및 섹션 준비 포함

1. 약 0.5mL의 조직 포매 젤로 조직 포매 카세트의 버튼을 덮은 다음 그림 2B와 같이 원하는 방향으로 조직 포매 젤에 매트릭스 겔 플러그를 즉시 놓습니다. 그런 다음 추가 티슈 매립 젤로 플러그를 끼웁니다.
2. 카세트를 -80°C 냉동실에 넣고 12시간 동안 굳힙니다.
3. 두꺼운 절편 준비를 위해 응고된 플러그 블록을 꺼내고 지침에 따라 냉동 마이크로톰을 사용하여 12μm 두께의 절편을 절단하고 현미경 슬라이드에 장착합니다.
4. 각 플러그 블록에서 5-10개의 섹션을 슬라이스합니다.

9. 혈관신생의 정량화(그림 3)

1. 10배 배율에서 488nm 파장의 도립 형광 현미경을 사용하여 단면의 5개 독립 필드에서 형광 이미지를 획득합니다.
2. Image J 소프트웨어(https://imagej.en.softonic.com/)로 이미지 파일을 열고 혈관신생 분석 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 HUVEC 위상차 분석 버튼을 클릭하고 통계 결과 테이블 로 전환하여 정보를 수집합니다. 각 섹션에 대해 획득한 5개의 형광 이미지를 모두 측정합니다.
3. 서로 다른 그룹의 신생혈관의 전체 길이를 분석하여 이들 그룹 간의 혈관신생 차이를 통계적으로 평가합니다.
   참고: 총 마스터 세그먼트 길이는 신생 선박의 전체 길이를 나타냅니다. 신생혈관의 길이를 늘리는 시약을 혈관신생 촉진(pro-angiogenic)이라고 하고, 신생혈관의 길이를 줄이는 시약을 항혈관신생(anti-angiogenic)이라고 합니다.

10. 혈관 투과성의 정량화(그림 4)

1. 20x 배율에서 488nm 파장의 도립 형광 현미경을 사용하여 단면의 5개 독립 필드에서 형광 이미지를 획득합니다.
2. 이미지 열기 file Image J 소프트웨어로. 자유형 선택 버튼을 클릭하고 누출 영역에 동그라미를 친 다음 분석 메뉴를 클릭하고 측정 옵션을 선택하여 누출 영역의 영역 정보를 가져옵니다. 누출 영역과 이미지 영역의 비율을 사용하여 혈관 투과성을 나타냅니다.
3. 서로 다른 그룹의 누출 면적과 이미지 면적의 비율을 분석하여 이러한 그룹 간의 혈관 투과성 차이를 통계적으로 평가합니다.

결과

그림 1 은 매트릭스 겔, 혈관 세포, 배양 배지 및 시약의 혼합물을 준비하는 방법을 나타내는 흐름도입니다. 이어서, 혼합물을 Nu/Nu 마우스의 뒤쪽에 피하 주사하고, 히팅 패드를 사용하여 가열하여 응고를 촉진하여 최종적으로 겔 플러그를 형성하였다.

그림 2A 는 형광 표지된 덱스트란이 있는 용기를 나타내는 흐름도입니다. 형광 ?...

토론

염색 없이 in vivo 혈관신생의 정량적 평가를 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 혈관 세포는 pro-angiogenic 또는 anti-angiogenic 시약의 존재 하에서 매트릭스 겔과 혼합된 다음 Nu/Nu 마우스의 뒤쪽에 피하 주사하여 겔 플러그를 형성했습니다(그림 1). 겔 플러그 형성 7일 후, 덱스트란-FITC를 정맥 주사하고 30분 동안 순환시켰다. 겔 플러그를 채취?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF