혈관신생 연구를 위한 수정된 In Vivo Matrix Gel Plug Assay

요약

여기에 제시된 방법은 염색 없이 생체 내에서 혈관신생 또는 혈관 투과성에 대한 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입을 사용하여 신생 혈관 또는 혈관 누출을 시각화합니다.

초록

생체 내 혈관 신생을 조사하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 그러나 이러한 모델의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 들거나 특수 장비가 필요하거나 후속 정량 분석을 위해 수행하기 어렵습니다. 여기서는 생체 내 혈관신생을 평가하기 위해 수정된 매트릭스 겔 플러그 분석을 제시합니다. 이 프로토콜에서, 혈관 세포를 pro-angiogenic 또는 anti-angiogenic 시약의 존재 또는 부재 하에서 매트릭스 겔과 혼합한 후, 수용 마우스의 등에 피하 주사하였다. 7일 후, 덱스트란-FITC를 함유한 인산염 완충 식염수를 꼬리정맥을 통해 주입하여 30분 동안 혈관 내에서 순환시킵니다. 매트릭스 겔 플러그를 채취하여 조직 포매 겔로 포매한 다음 염색 없이 형광 검출을 위해 12μm 절편을 절단합니다. 이 분석에서 고분자량(~150,000Da)의 dextran-FITC는 길이를 검출하기 위한 기능성 용기를 나타내는 데 사용할 수 있으며, 저분자량(~4,400Da)의 dextran-FITC는 신생 혈관의 투과성을 나타내는 데 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 생체 내 혈관신생의 정량적 연구를 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법을 제공할 수 있습니다.

서문

기존 혈관에서 신생 혈관을 형성하는 과정인 혈관신생은 배아 발달, 상처 치유, 죽상동맥경화증, 종양 발달 등과 같은 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.1,2,3,4,5. 이 역동적인 과정에는 매트릭스의 분해, 혈관 세포 증식, 관 구조를 형성하기 위한 이동 및 자기 조직화, 신생 혈관의 안정화⁶ 등 여러 단계가 포함된다. 혈관신생을 촉진하는 것은 심근경색, 뇌졸중 및 기타 허혈성 질환7의 치료에 중요한 것으로 입증^{되었으며, 혈관}신생을 억제하는 것은 암⁸ 및 류마티스 질환⁹의 치료에 있어 유망한 전략으로 간주되어 왔다. 혈관신생은 신약 개발의 조직 원리로 간주되어 왔다¹⁰. 따라서, 혈관신생의 정도를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법의 구축은 혈관신생 의존성 질환....

프로토콜

동물 피험자와 관련된 모든 절차는 원저우 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(XMSQ2021-0057, 2021년 7월 19^일). 모든 시약과 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 배양 배지 준비

1. 10x M199 배양 배지: M199 분말을 탈이온수 90mL로 10배 농도로 용해하고 소 태아 혈청(FBS) 10mL를 첨가한 다음 0.22μm 필터를 통과시킵니다. 배지를 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다.
2. 완전한 내피 배양 배지: 460mL의 내피 세포 배지(ECM)에 FBS 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 5mL, 내피 세포 성장 보충제 5mL를 추가합니다. 배지를 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.

2. 혈관 세포 준비

1. 1 x 10⁵ 혈관 세포(1차 배양 내피 전구 세포¹⁴, 내피 세포 또는 내피 세포주)를 37°C 및 5% CO₂ - 70% 밀도에서 100mm 조직 배양 접시에 ....

토론

염색 없이 in vivo 혈관신생의 정량적 평가를 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 혈관 세포는 pro-angiogenic 또는 anti-angiogenic 시약의 존재 하에서 매트릭스 겔과 혼합된 다음 Nu/Nu 마우스의 뒤쪽에 피하 주사하여 겔 플러그를 형성했습니다(그림 1). 겔 플러그 형성 7일 후, 덱스트란-FITC를 정맥 주사하고 30분 동안 순환시켰다. 겔 플러그를 채취?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF