שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

Summary

השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.

Abstract

מספר מודלים פותחו כדי לחקור אנגיוגנזה in vivo. עם זאת, רוב המודלים הללו מורכבים ויקרים, דורשים ציוד מיוחד, או קשה לבצע אותם לניתוח כמותי לאחר מכן. כאן אנו מציגים בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה להערכת אנגיוגנזה in vivo. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות או היעדר ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת עורית לגבם של עכברים מושתלים. לאחר 7 ימים, מלח חיץ פוספט המכיל dextran-FITC מוזרק דרך וריד הזנב ומופץ בכלי הדם במשך 30 דקות. תקעי ג'ל מטריקס נאספים ומוטבעים בג'ל הטבעה רקמות, ואז חותכים קטעי 12 מיקרומטר לזיהוי פלואורסצנטי ללא כתמים. בבדיקה זו, dextran-FITC עם משקל מולקולרי גבוה (~ 150,000 Da) יכול לשמש כדי לציין כלי דם פונקציונליים לגילוי אורכם, בעוד dextran-FITC עם משקל מולקולרי נמוך (~ 4,400 Da) יכול לשמש כדי לציין את החדירות של neo-vessels. לסיכום, פרוטוקול זה יכול לספק שיטה אמינה ונוחה למחקר כמותי של אנגיוגנזה in vivo.

Introduction

אנגיוגנזה, תהליך היווצרות כלי הדם הניאו-כליים מכלי דם קיימים, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, טרשת עורקים, התפתחות גידולים וכו '^.1,2,3,4,5. תהליך דינמי זה כולל מספר שלבים, כולל השפלה של המטריצה, התפשטות תאי כלי דם, הגירה וארגון עצמי ליצירת מבנים צינוריים וייצוב של כלי הדם^6. קידום אנגיוגנזה הוכח כקריטי בטיפול באוטם שריר הלב, שבץ וסוגים אחרים של מחלות איסכמיות⁷ תוך עיכוב אנגיוגנזה נחשב אסטרטגיה מבטיחה בטיפול בסרטן⁸ ומחלות שגרונית⁹. אנגיוגנזה נחשבת לעיקרון מארגן לגילוי תרופות¹⁰. לפיכך, בניית שיטה אמינה ונוחה להערכת היקף האנגיוגנזה היא קריטית למחקר מכני או גילוי תרופות במחלות תלויות אנגיוגנזה.

מספר מודלים in vitro ו- in vivo פותחו כדי להעריך אנגיוגנזה¹¹. בין אלה, מודלים דו-ממדיים (2-D), כמו בדיקת היווצרות צינור ג'ל מטריצה¹², אינם יכולים ליצור מבנים צינוריים פונקציונליים. המודלים של בעלי החיים, כגון איסכמיה של הגפה האחורית מודל^13,14, יכולים לשחזר את תהליך האנגיוגנזה אך הם מורכבים ודורשים מערכת הדמיה של זרימת דם בלייזר. מודלים תלת ממדיים של מורפוגנזה וסקולרית, כמו בדיקת תקע ג'ל מטריצה, מספקים פלטפורמה פשוטה שיכולה לחקות את תהליך האנגיוגנזה in vivo¹⁵, אך זיהוי אנגיוגנזה דורש אימונוהיסטוכימיה או צביעת אימונופלואורסנציה 16,17,18, שהם משתנים ומדמיינים בצורה גרועה.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה שבו תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריצה והוזרקו תת עורית לחלק האחורי של עכברים כדי ליצור תקע. בתקע, תאי כלי הדם צריכים לפרק את המטריצה, להתרבות, לנדוד ולהתארגן בעצמם כדי ליצור סוף סוף כלי דם פונקציונליים עם זרימת הדם בסביבה הפנימית. לאחר מכן, דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית מוזרק דרך וריד הזנב, כדי לזרום דרך התקע, והתווית מומחשת כדי לציין ניאו-כלי. התוכן של אנגיוגנזה ניתן להעריך כמותית על ידי אורך כלי. שיטה זו יכולה ליצור כלי דם פונקציונליים שלא ניתן לייצר במודלים אנגיוגנזה דו-ממדית¹², ואינה זקוקה לתהליך כתמים מורכב כמו בבדיקת תקע ג'ל מטריצה רגילה¹¹. זה גם לא דורש מכשירים ספציפיים יקרים כמו מערכת הדמיה זרימת דם לייזר כתמים באיסכמיה של הגפיים האחוריות מודל 13,14,19. שיטה זו היא רב-תכליתית, זולה, ניתנת לכימות וקלה לביצוע, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את היכולת הפרו-אנגיוגנית או האנטי-אנגיוגנית של תרופות או לשמש במחקר מכני המעורב באנגיוגנזה.

Protocol

כל הנהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו (XMSQ2021-0057, 19 ביולי 2021). כל הריאגנטים והחומרים המתכלים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיום תרבות

1. מדיום תרבית M199 10x: יש להמיס אבקת M199 לריכוז של פי 10 עם 90 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ולהוסיף 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ולאחר מכן לעבור דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
2. מדיום תרבית אנדותל מלא: הוסף 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, ו-5 מ"ל של תוספת גדילה של תאי אנדותל ל-460 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM). יש לאחסן את המדיום ב-4°C למשך עד חודש אחד.

2. הכנת תאי כלי דם

1. תרבית 1 x 10⁵ תאי כלי דם (תאי אב אנדותל ראשוניים^{בתרבית 14}, תאי אנדותל, או קווי תאי אנדותל) עם 8 מ"ל של תרבית אנדותל מלאה בינונית בצלחת תרבית רקמה של 100 מ"מ ב 37 ° C ו 5% CO₂ עד 70% מפגש.
2. הסר את מדיום התרבית ושטוף את הכלי 2x עם 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) כדי להסיר תאים לא מחוברים ולכלוך. יש להסיר PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין המכיל 2.21 mM EDTA, ולדגור ב-37°C למשך דקה אחת.
3. נטרלו את הטריפסין עם 7 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה, ושטפו בעדינות תאים מצלחת התרבית. יש לאשר ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה פי 40).
4. יש לאסוף את תרחיף התאים בצינור של 15 מ"ל ובצנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend תאים עם 5 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה.
5. לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהעביר תרחיף המכיל 2 x 10⁶ תאים לצינור סטרילי 1.5 מ"ל. כל תקע מכיל 1.5 x 10⁶ תאים, 25% תאים נוספים משמשים במקרה של פסולת. כל קבוצה כוללת לפחות 3 תקעים.
   הערה: לאחר ניסויים נמצא כי 1.5 x 10⁶ תאים ב 300 μL של ג'ל מטריצה הוביל להתפתחות נכונה של אנגיוגנזה ולכן נבחר לניסויים.
6. תרחיף תאי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות לתאי כדור, ולאחר מכן להסיר supernatant.

3. הכנת ג'ל מטריקס

1. טרום קירור סטרילי 1.5 מ"ל צינורות המכילים גלולת תא באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. מצננים מראש מזרקי אינסולין 30G 1 מ"ל במקרר 4°C.
2. להפשיר לחלוטין ג'ל מטריצה באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. אין לערבב או לערבל. קירור מראש 10x M199 ובדיקת מגיב/תרופת עניין באמבט מים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. יש לערבב ג'ל מטריצה מקורר מראש עם 10x M199 המכיל 10% FBS ואת הריאגנט שייבדק ביחס נפח של 8.8:1:0.2 כדי לקבל ג'ל מטריצה ותערובת M199 המכילה 1% FBS והמגיב.
4. יש להשהות תאים עם 400 μL של תערובת ג'ל המטריצה, לערבב בעדינות כדי למנוע יצירת בועות. שמור את הצינור על קרח עד שהעכברים מוכנים להזרקה. שמור את תערובת ג'ל מטריצה על קרח כל הזמן כדי למנוע קרישה.
   הערה: כאן, 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה המכילה 1.5 x 10⁶ תאים שימש ליצירת תקע ג'ל. הכינו תוספת של 25% ג'ל לפי 25% תאים נוספים בשלב 2.

4. הכנת עכבר

1. מרדימים עכבר Nu/Nu זכר בן 6-8 שבועות (18-25 גרם) בתא מכשיר ההרדמה של בעלי חיים עם איזופלורן (3% איזופלורן ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה). לאחר הרדמה מוצלחת, שאושרה על ידי היעדר רפלקס תיקון ורפלקס צביטת בוהן, הוציאו את העכבר מהחדר, הוציאו את העכבר מהחדר והניחו מסכת הרדמה על העכבר ושנו את ריכוז האיזופלורן ל -1.5% ב -100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה.
   הערה: ספק תמיכה תרמית לבעל החיים באמצעות כרית חימום לאורך כל ההליך.
2. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש. הדביקו את הגפיים של העכברים על לוח הניתוח במצב נוטה.

5. הזרקת תערובת ג'ל מטריקס

1. טען 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה לתוך מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 30G. הימנעו מהיווצרות בועות. טען במהירות את ג'ל המטריצה (תוך 2 דקות) כדי למנוע התמצקות במהלך זמן זה. הניחו מיד את מזרק האינסולין עמוס בג'ל מטריקס על קרח.
2. נקו את העור על גבם של עכברים באמצעות רפידות 75% אלכוהול. תת עורית להזריק 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה בצד אחד של החלק האחורי של עכברים.
3. הסר בעדינות את המחט מאתר ההזרקה כדי למנוע דליפה של תערובת ג'ל המטריצה. בדקו אם יש גיבנת קטנה באתר ההזרקה (איור 1).
4. הניחו את העכבר על כרית החימום למשך 2 דקות כדי לאפשר לתערובת ג'ל המטריקס לנקרש וליצור תקע.
5. חזור על שלבים 5.2. ל-5.4. כדי ליצור תקע בצד השני של גב העכבר. סמן את קצות הדבשת באמצעות עט טוש.
6. התבונן בעכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. שים את העכבר בכלוב נפרד עד שהוא התאושש לחלוטין. אחסן את העכברים במעבדת בעלי חיים ניסיונית מסוג SPF ב 22 ± 2 ° C עם מחזור אור / חושך של 12 שעות במשך 7 ימים.

6. הזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב

1. לאחר 7 ימים של הזרקת ג'ל מטריצה, יש להשהות מחדש 0.5 מ"ג של דקסטרן-FITC עם 500 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול (ddH₂O) ולאחר מכן מערבלים באלימות כדי לקבל את תמיסת דקסטרן-FITC בריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם/μL.
   הערה: השתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~150 kDa לבדיקת אנגיוגנזה, והשתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~4 kDa לבדיקת חדירות כלי דם.
2. טען 50 μL של תמיסת dextran-FITC לתוך מזרקי 29G.
3. תקן את העכבר במכשיר הזרקת וריד הזנב. נקו את הזנב עם כדור צמר גפן 75% אלכוהול והזריקו בעדינות 50 מיקרוליטר של דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב.
4. דחסו את אתר ההזרקה עם צמר גפן למשך דקה אחת כדי לעצור דימום, ואז החזירו את העכברים לכלוב למשך 30 דקות.
5. חזור על שלבים 6.3. ו-6.4. עד שכל העכברים יקבלו זריקת דקסטרן-FITC.

7. אוסף תקעי ג'ל מטריקס

1. הזרקה תוך-צפקית של 1% נתרן פנטוברביטלי ב-PBS (200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) והרדמת העכברים בהליך מאושר על ידי IACUC.
2. חותכים את העור לאורך הגבול המסומן של התקע באמצעות מספריים כירורגיים ולהסיר את העור מעל תקע ג'ל המטריצה.
3. אספו את התקע ושטפו בכד קטן עם PBS 1x כדי לשטוף דם עודף (איור 2A). צבע התקע יכול לתאר באופן גס את מידת שפע הדם ואת תכולת כלי הדם (איור 3A).

8. הטמעת תקע ג'ל מטריצה והכנת חתך

1. כסו את הכפתור של קלטת ההטבעה של הרקמה בכ-0.5 מ"ל של ג'ל הטבעה של רקמות, ולאחר מכן הניחו מיד את תקע ג'ל המטריצה על ג'ל ההטבעה של הרקמה בכיוון הרצוי כפי שמוצג באיור 2B. לאחר מכן, להטביע את התקע עם ג'ל הטבעה רקמות נוסף.
2. הכניסו את הקלטות למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 12 שעות כדי להתמצק.
3. להכנת חתך עבה, מוציאים את בלוק התקע המוצק וחותכים מקטעים בעובי 12 מיקרומטר באמצעות המיקרוטום המקפיא בהתאם להוראה, ומרכיבים על שקופיות מיקרוסקופ.
4. פורסים 5-10 חלקים מכל בלוק תקע.

9. כימות אנגיוגנזה (איור 3)

1. קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 10.
2. פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J (https://imagej.en.softonic.com/) ולחץ על הלחצן Angiogenesis Analyze . לאחר מכן, לחץ על לחצן נתח ניגודיות פאזות HUVEC ועבור לטבלת תוצאות סטטיסטיות כדי לאסוף מידע. מדוד את כל 5 תמונות הפלואורסצנטיות שנרכשו עבור כל קטע.
3. לנתח את האורך הכולל של neo-vessels מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל באנגיוגנזה בין קבוצות אלה.
   הערה: אורך מקטעי האב הכולל מציין את האורך הכולל של כלי הניאו. המגיב שמגדיל את אורך הניאו-כלי נקרא פרו-אנגיוגני, ואילו המגיב שמקטין את אורך הניאו-כלי הוא אנטי-אנגיוגני.

10. כימות חדירות כלי הדם (איור 4)

1. קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 20.
2. פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J. לחץ על כפתור הבחירה ביד חופשית והקף את אזור הדליפה, ולאחר מכן לחץ על תפריט ניתוח ובחר באפשרות מדידה כדי לקבל את פרטי האזור של אזור הדליפה. השתמש ביחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה כדי לציין חדירות כלי דם.
3. נתח את היחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל בחדירות כלי הדם בין קבוצות אלה.

תוצאות

איור 1 הוא תרשים זרימה המתאר כיצד להכין את התערובת של ג'ל מטריצה, תאי כלי דם, מדיום תרבית ומגיב. לאחר מכן התערובת הוזרקה באופן תת-עורי לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu וחוממה באמצעות כרית חימום כדי להאיץ את הקרישה שלה כדי ליצור לבסוף תקע ג'ל.

איור 2A הוא ת...

Discussion

אנו מציגים שיטה אמינה ונוחה להערכה כמותית של אנגיוגנזה in vivo ללא כתמים. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת-עורית לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu כדי ליצור תקע ג'ל (איור 1). לאחר 7 ימים של היווצרות ת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF