使用稳定同位素标记 LC-TIMS-TOF MS/MS 从 头 追踪脂质

摘要

这里介绍的是一种利用其保留时间、迁移率和碎裂通过稳定同位素标记来筛选脂质结构的方法。

摘要

脂质高度多样化，脂质结构和组成的微小变化会对关键的生物学功能产生深远的影响。稳定同位素标记 （SIL） 为研究脂质分布、动员和代谢以及 从头 脂质合成提供了多种优势。SIL 技术的成功实施需要去除内源性分子的干扰。在本工作中，我们描述了一种用于从生物样品中筛选 SIL 脂质的高通量分析方案;将显示蚊子卵巢发育过程中脂质 从头 鉴定的示例。使用互补液相色谱捕获离子淌度光谱和质谱允许在单次扫描 （<1 h） 中从单个样品中分离和分配脂质。所描述的方法利用了数据依赖性采集和数据非依赖性采集的最新发展，在迁移陷阱中使用平行积累，然后是连续碎裂和碰撞诱导解离。脂肪酸链水平的 SIL 测量揭示了蚊子卵巢发育过程中脂质动力学的变化。脂质 从头 结构根据其保留时间、迁移率和碎裂模式进行可靠分配。

引言

在分析脂质数据时，稳定同位素标记 （SIL） 是评估生物体代谢途径的有效方法。在这种方法中，分析物中的原子被含有 ¹³C 或 ²H 的稳定同位素取代。这些同位素进一步掺入前体中，这些前体随后嵌入脂肪酸中，标记它们所在的区域。使用这些同位素，人们能够识别脂质的分布和代谢，因为它们会与未标记的背景形成对比¹。常见的质谱平台无法区分来自内源性分子的信号²。SIL 的成功需要使用超高分辨率的分析工具。液相色谱与高分辨率捕获离子淌度质谱-平行累积顺序碎裂-飞行时间串联质谱 （LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS） 联用，可分离标记和未标记物质²。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析的优势在于，可以通过保留时间 （RT） 和淌度过滤 MS 信号，从而减少内源性分子的潜在干扰，以及所有所需物质的定量和分离²。在 TIMS 中，离子首先在气体流动相上保持静止，然后根据其迁移率释放。这提供了高分辨率的移动图，同时在比早期 IMS 仪器更低的电压下运行³.移动量图是质量电荷与漂移时间的关系图，可用于根据化合物的漂移时间和重叠量来区分化合物⁴。

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研究方案

1. 样品制备

1. 昆虫解剖
   1. 使用微针解剖 埃及伊蚊 卵巢，当它们 7 天大时，在磷酸盐缓冲盐水溶液中。
   2. 使用微针从磷酸盐缓冲盐水溶液中收集八个卵巢，并储存在 -80 °C 的 1.5 mL 微量离心管中。
   3. 在生物重复中收集卵巢。
2. 脂质提取
   1. 将 10 μL 内标 （ISTD） 加入收集的 8 个卵巢中，浓度为 1 ppm。ISTD 是一种标记的脂质混合物，含有 7 个 1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱-D7 的氘（15： 0-18：1 （D7） PC）、溶血磷脂酰胆碱-D7 （18：1 （D7） Lyso PC）、1-十五烷酰-2-十八碳烯酰-甘油-3-磷酸乙醇胺-D7 （15：0-18：1 （D7） PE）、1-油酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-D7 （18：1 （D7） Lyso PE）、1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇-D7 （15：0-18：1 （D7） PI）、1-十五烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸-D7 （15：0-18：1 （D7） PS）、1,2-二十五碳酰基-3-十八碳烯酰-sn-甘油（15：0-18：1-15：0 （D7） TAG）、1-十五碳酰-2-十八碳烯酰基）-sn-甘油-D7 （15：0-18：1 （D7） DAG）、2-十八碳烯酰-sn-甘油-D7 （18：1 ....

讨论

在评估该方案的使用情况时，必须确保 DIA-PASEF 和 MS/MS 参数适用于所讨论的甘油三酯。具体来说，活动窗口和窗口宽度应遵循甘油三酯的模式。这可以通过使用 DDA 方法的上一次运行来确定。在追踪内标中的甘油三酯时，DIA 设置的窗口应覆盖所有预先确定的目标分子。窗口的大小应相等，范围在所需化合物的 m/z 和 1/k0 范围内（图 7）。如果窗口大小不正确，将跳过要碎裂的.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36