Tracciamento de novo dei lipidi mediante marcatura isotopica stabile LC-TIMS-TOF MS/MS

Riepilogo

Qui viene presentato un metodo per lo screening delle strutture lipidiche attraverso la marcatura degli isotopi stabili utilizzando il loro tempo di ritenzione, mobilità e frammentazione.

Abstract

I lipidi sono molto diversi e piccoli cambiamenti nelle strutture e nella composizione dei lipidi possono avere effetti profondi sulle funzioni biologiche critiche. La marcatura degli isotopi stabili (SIL) offre diversi vantaggi per lo studio della distribuzione, della mobilizzazione e del metabolismo dei lipidi, nonché per la sintesi de novo dei lipidi. Il successo dell'implementazione della tecnica SIL richiede la rimozione delle interferenze dalle molecole endogene. Nel presente lavoro, descriviamo un protocollo analitico ad alto rendimento per lo screening di lipidi SIL da campioni biologici; Verranno mostrati esempi di identificazione de novo lipidica durante lo sviluppo delle ovaie delle zanzare. L'uso della cromatografia liquida complementare, della spettrometria di mobilità ionica intrappolata e della spettrometria di massa consente la separazione e l'assegnazione dei lipidi da un singolo campione in un'unica scansione (<1 ora). L'approccio descritto si avvale dei recenti sviluppi nell'acquisizione dipendente dai dati e nell'acquisizione indipendente dai dati, utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità seguita dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta dalla collisione. La misurazione del SIL a livello della catena degli acidi grassi rivela cambiamenti nella dinamica dei lipidi durante lo sviluppo ovarico delle zanzare. Le strutture dei lipidi de novo vengono assegnate con sicurezza in base al tempo di ritenzione, alla mobilità e al modello di frammentazione.

Introduzione

Nell'analisi dei dati lipidici, la marcatura degli isotopi stabili (SIL) è un metodo efficace per valutare le vie metaboliche negli organismi viventi. In questo metodo, gli atomi all'interno di un analita sono sostituiti da isotopi stabili contenenti ¹³C o ²H. Questi isotopi sono ulteriormente incorporati nei precursori, che vengono successivamente incorporati negli acidi grassi, etichettando le aree in cui risiedono. Con questi isotopi, si è in grado di identificare la distribuzione e il metabolismo dei lipidi, in quanto contrasteranno con il fondo non marcato¹. Le comuni piattaforme di spettrometria di massa non sono in grado di distinguere il segnale proveniente dalle molecole endogene². Il successo di SIL richiede l'uso di strumenti analitici ad altissima risoluzione. La cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di mobilità ionica intrappolata ad alta risoluzione-frammentazione sequenziale ad accumulo parallelo-spettrometria di massa tandem a tempo di volo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) consente la separazione di specie marcate e non marcate². Il vantaggio dell'analisi LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS è che il segnale MS può essere filtrato in base al tempo di ritenzione (RT) e alla mobilità, riducendo così le potenziali interferenze delle molecole endogene, nonché la quantificazione e la separazione di tutte le specie desiderate². Nella TIMS, uno ione viene prima tenuto fermo contro una fase gas-mobile e successivamente rilasciato in base alla sua mobilità. Ciò fornisce mobilogrammi ad alta risoluzione pur operando a una tensione inferiore rispetto alla precedente strumentazione IMS³. I mobilogrammi sono grafici della massa da caricare rispetto al tempo di deriva che possono essere utilizzati per distinguere tra i composti in base al loro tempo di deriva e alla quantità di sovrapposizione⁴.

Utilizzando una tecnica PASEF aggiuntiva, la velocità di sequenziamento viene notevolmente aumentata senza sacrificare la sensibilità⁵. La teoria PASEF prevede l'accumulo di ioni seguito dal loro rilascio sequenziale nell'ordine della loro mobilità. Questo viene fatto accumulando ioni in parallelo all'allineamento della loro mobilità. L'accumulo in questo modo impedisce la perdita di ioni. Inoltre, la selezione degli ioni precursori avviene contemporaneamente all'accumulo e al rilascio degli ioni. Con questo metodo, PASEF seleziona più precursori in serie durante ogni scansione TIMS, piuttosto che i singoli precursori per scansione tipici di uno strumento TIMS che non utilizza PASEF. Quando gli ioni precursori vengono accumulati contemporaneamente e rilasciati in picchi di 2 ms all'interno di una scansione TIMS di circa 100 ms per fotogramma, il segnale viene amplificato di oltre un ordine di grandezza, aumentando così il rapporto segnale/rumore³. L'aggiunta di PASEF al TIMS aumenta l'efficienza dell'MS/MS. Poiché il TIMS-PASEF è accoppiato con MS/MS, è possibile una frammentazione più efficiente. A differenza del rilevamento MS/MS convenzionale, il segnale del precursore viene compresso dal TIMS-PASEF e gli ioni frammento vengono rilevati contemporaneamente al tempo di eluizione TIMS e alla posizione di mobilità ionica del precursore³.

Quando si acquisiscono dati da uno spettrometro di massa, ci sono opzioni nella modalità di scansione desiderata. L'acquisizione dipendente dai dati (DDA) seleziona gli ioni precursori dalla scansione MS1 in base alla loro abbondanza, prima di frammentarli ed eseguire la scansione MS2. Questa modalità di scansione frammenta il maggior numero possibile di precursori. L'approccio DDA è mirato e i risultati dipenderanno dalla selezione ionica³. Tuttavia, DDA-PASEF ha spesso problemi nella riproducibilità tra le repliche. Sebbene DDA sia un ottimo strumento in un'analisi mirata, le miscele complesse hanno maggiori difficoltà nell'acquisizione dei dati⁶. Questo perché solo una piccola quantità di ioni può essere monitorata contemporaneamente³. L'acquisizione indipendente dai dati (DIA) è un metodo in cui le finestre preselezionate di m/z sono frammentate indipendentemente dalla loro intensità e tutte vengono scansionate entro l'intervallo⁷. Con questa modalità di scansione, intere nuvole di ioni vengono trasmesse dall'IMS allo spettrometro di massa³. Negli studi di proteomica ciò si traduce in una maggiore quantità di proteine quantificate in un arco di tempo più breve rispetto alla DDA. Inoltre, la DIA perde meno valori m/z rispetto alla DDA. Pertanto, questa alternativa ha mostrato grandi miglioramenti nella riproducibilità dei dati nel rapporto segnale/rumore e una migliore quantificazione rispetto alla DDA. In questo lavoro, il nostro obiettivo è quello di implementare la DIA secondo il metodo riportato da Tose et ^al.2. Abbiamo migliorato la riproducibilità e l'intensità dei segnali, fornendo ulteriori e più conclusive informazioni sulla mobilizzazione, distribuzione e metabolismo dei lipidi SIL in campioni biologici sfruttando l'acquisizione di DDA e DIA.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Dissezione degli insetti
   1. Sezionare le ovaie di zanzara Aedes aegypti quando hanno 7 giorni di vita in una soluzione salina tamponata con fosfato utilizzando microaghi.
   2. Raccogliere otto ovaie da una soluzione salina tamponata con fosfato utilizzando microaghi e conservare in provette da microcentrifuga da 1,5 ml a -80 °C.
   3. Raccogliere le ovaie in repliche biologiche.
2. Estrazione dei lipidi
   1. Aggiungere 10 μL di standard interno (ISTD) nelle otto ovaie raccolte in una concentrazione di 1 ppm. L'ISTD è una miscela lipidica marcata con sette deuterio di 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:15:15 0-18:1 (D7) PC), lisofosfatidilcolina-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil-glicero-3-fosfoetanolammina-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-idrossi-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositolo-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoil-3-ottadecenoil-sn-glicerolo (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil)-sn-glicerolo-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-ottadecenoil-sn-glicerolo-D7 (18:1 MAG (D7)), colesterolo oleato-D7 [18:1 (D7) estere di colesterolo).
   2. Attendere che si asciughi a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μl di butanolo/metanolo e 3 μl di butilidrossitoluene. Omogeneizzare manualmente per 10 s con pestelli in polipropilene da 1,5 mL.
   3. Sciacquare il pestello con 200 μL di butanolo/metanolo e unirlo alla soluzione omogeneizzata.
   4. Sonicare la provetta della microcentrifuga a temperatura ambiente e potenza media per 30 minuti.
   5. Provette da centrifuga a 1600 x g per 10 min a 20 °C. Trasferire il surnatante in una fiala dell'autocampionatore con 300 μl di inserti in vetro silanizzato.

2. Configurazione dello strumento

1. Preparazione della fase mobile
   1. Preparare la fase mobile con una composizione di 30:40:30 (fase mobile A) e 10:5:85 (fase mobile B) utilizzando acetonitrile, acqua e isopropanolo come rispettiva proporzione. In entrambe le fasi mobili, aggiungere 10 mmol/L di formiato di ammonio in acqua e lo 0,1% di acido formico per creare una condizione tampone.
   2. Pesare 3,15 g di formiato di ammonio in 10 ml di acqua. Aggiungere 500 μL di questa soluzione in 12,5 mL di acqua. In sequenza, mettere in un matraccio tarato da 250 mL e riempire con isopropanolo fino a circa 2/3 del pallone. Mescolare roteando.
   3. Aggiungere 250 μL di acido formico (85%), riempire con 25 mL di acetonitrile e isopropanolo alla linea di riempimento di 250 mL e mescolare.
2. Nel sistema MS, sul lato sinistro dello schermo con le impostazioni MS, determinare l'intervallo di massa selezionando 50 come impostazione minima e 1850 come impostazione di scansione massima.
   1. Selezionare Polarità come modalità ioni positivi. Selezionare la modalità di scansione come DIA-PASEF. A tale scopo, selezionare Ottimizza e apri metodo di analisi da un metodo DDA precedente con i seguenti parametri LC.
      1. Per la separazione del gradiente:
         Iniezione del campione: 0% B, tempo di mantenimento 1 min.
         Aumentare al 55% B, tenere premuto fino a 6,4 min.
         Aumentare al 65% B, tenere premuto fino a 24 min.
         Aumentare a 88% B, tenere premuto fino a 40,8 min.
         Aumentare al 95% B, tenere premuto fino a 48,1 min.
         Diminuire al 35% B, tenere premuto fino a 56 min.
         Diminuire a 0% B, tenere premuto fino a 60 min.
      2. Per le condizioni HPLC:
         Volume di iniezione: 5 μl
         Velocità del solvente: 0,25 mL/min
         Tempo di esecuzione totale: 60 min, di cui 5 min servono a precondizionare la colonna.
      3. Preparare il cromatografo liquido inserendo la colonna nel cromatografo liquido. Eseguire un pezzo grezzo per pulire la colonna e verificare la presenza di perdite. Questo può essere visto nello strumento che non mantiene la pressione o il flusso.
3. Per creare un nuovo metodo, eseguire i passaggi descritti di seguito (Figura 1 e Figura 2).
   1. Apri il software e fai clic su Connetti tutti gli strumenti. Se la connessione ha esito positivo, il sistema LC emette un segnale acustico e la schermata di controllo elenca HyStar nella casella Stato senza alcun messaggio di errore.
   2. Fare clic sulla scheda Acquisizione . Nel Navigatore tabelle di esempio, individuare il menu a discesa dei tag e selezionare un metodo precedente.
   3. Raddoppia l'ultima tabella di esempio. Fare clic su Salva con nome... e salvare la nuova lista di campioni con il formato: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) dove (XXXX) è un breve descrittore dell'analisi.
   4. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul metodo di separazione e fare clic su Modifica metodo. Fare clic su Modifica metodo modulo.
   5. Fare clic su Download. In caso di esito positivo, verrà visualizzato il download riuscito. Metodo di chiusura dello schermo senza salvataggio.
   6. In Impostazioni MS vai alle impostazioni TIMS, seleziona l'inizio 1/k0 a 0,70 e 1/k0 termina a 1,85. Impostare il tempo di rampa su 150 ms. In questo modo, il ciclo di lavoro e la velocità di rampa vengono regolati automaticamente.
   7. Nella finestra inferiore, seleziona la scheda Origine . Selezionare il tipo di sorgente come ESI e impostare l'offset della piastra terminale su 800 V e il capillare su 4500 V. Controllare la scatola del nebulizzatore e impostare la pressione su 4,0 bar. Impostare il gas secco a 4,0 L/min e la temperatura secca a 250 °C.
   8. A destra della scheda sorgente, selezionare la scheda Sintonizzazione. Fare clic sulla scheda Sottoscheda Generale e sotto l'intestazione di trasferimento assicurarsi dei seguenti parametri:
      Deflessione 1 triangolo: 70 V
      Imbuto 1 RF: 250 vpp
      Energia isCID: 0 eV
      Imbuto 2 RF: 250 vpp
      RF multipolare: 500 vpp.
      1. Sotto l'intestazione della cella di collisione, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti:
         Energia di collisione: 6,0 eV
         Collisione RF: 1200 vpp.
      2. Sotto la voce quadrupolo assicurarsi che i seguenti parametri siano i seguenti:
         Energia ionica: 6 eV
         Massa ridotta: 250 m/z.
      3. Nella scheda pre-TOF a fuoco assicurarsi che i seguenti parametri siano rispettati:
         Tempo di trasferimento: 45 μs
         Memorizzazione pre-impulso: 5,0 μs.
   9. Fare clic sulla sottoscheda Elaborazione . Il rilevamento dei picchi sotto gli spettri di massa garantisce i seguenti parametri:
      Soglia assoluta: 667
      Soglia assoluta (per 100 ms AccuTime): 445.
      1. Il rilevamento dei picchi di mobilità inferiore garantisce i seguenti parametri:
         Soglia assoluta: 30,00.
   10. Fare clic sulla sottoscheda TIMS . Nella scheda Offset verificare i seguenti parametri:
       Δt1: -20 V
       Δt2: -150 V
       Δt3: 70 V
       Δt4: 150 V
       Δt5: 0 V
       Δt6: 150 V
       Cella di collisione: 300 V.
   11. A destra della scheda Tune, fare clic sulla scheda MS/MS . Nella scheda degli ioni precursori, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti:
       Numero di rampe PASEF: 8
       Carica minima: 1
       Carica massima: 1.
       1. Nella scheda di pianificazione, fai clic su Avanzate e assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti:
          Intensità: 0,1500, 5000, 10000
          Ripetizione: 1, 10, 5, 1
          Soglia di intensità: 1500.
       2. Nella scheda di esclusione attiva, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti:
          Segno di spunta di esclusione attiva
          Rilascio dopo: 0,4 min.
       3. Nelle impostazioni di energia di collisione, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti:
          K0 (V-s/cm³): 0,70, 1,60
          Energia di collisione (eV): 20.00, 35.00.
       4. Nelle impostazioni della larghezza di isolamento, assicurati che i seguenti parametri siano i seguenti:
          Massa (m/z): 622, 1222
          Larghezza (m/z): 1,00 2,50.
   12. Configurazione DIA -PASEF: selezionare DIA-PASEF dalla modalità di scansione delle impostazioni MS a sinistra. Nella scheda MS/MS, selezionare Editor di finestre. Qui, assicurati dei seguenti parametri (Figura 3):
       Impostazioni finestra: Larghezza di massa: 50 Da; Sovrapposizione di massa: 0,0 Da; Calcola da poligono: passi di massa; Numero di finestre di mobilità: 1.

3. Calibrazione

1. Taratura dello strumento (Figura 4)
   1. Nella sottoscheda Calibrazione , fare clic su m/z, selezionare Tuning Mix dalla casella a discesa e fare clic su Calibra nell'angolo in basso a destra.
   2. Continuare a fare clic su Calibra fino a raggiungere un punteggio del 100%.
   3. Ora seleziona la scheda Mobilità e segui gli stessi passaggi di cui sopra fino a raggiungere il punteggio di calibrazione del 100%.
2. Curva di calibrazione
   1. Miscela standard interna di lipidi spike con 10 μl di miscela standard interna deuterata.
      Utilizzare sette punti di calibrazione da 0,1 a 500 ng/mL di miscela standard con 10 μL di miscela standard interna deuterata.
   2. Annotare manualmente le catene degli acidi grassi in base ai modelli PASEF MS/MS già descritti in².
3. Efficienza dell'etichettatura SIL
   1. Calcolare il rapporto tra l'area degli isotopi contenenti SIL e l'area degli isotopi non contenenti SIL.
   2. Calcola il modello teorico determinando la probabilità di trovare un atomo marcato in qualsiasi sito.
   3. Calcolare l'arricchimento SIL adattando i profili isotopici sperimentali con il pattern teorico simulato su software di analisi dei dati.
4. Avvio della corsa
   1. Attiva il forno a colonna facendo clic sul pulsante Termometro . Attiva le pompe facendo clic sul pulsante Valvola .
   2. Impostare il metodo MS sul metodo salvato in precedenza. Verificare che il volume di iniezione sia di 5 μl e che la linea 1 miri al flaconcino 20:1.
   3. Assicurarsi che la fiala 20:1 contenga il 50% di IPA/ACN. Salva l'elenco dei campioni.
   4. Avviare la sequenza e verificare che l'iniezione sia avvenuta correttamente (confermata da un messaggio visualizzato sul sistema che indica l'iniezione).
   5. Copia la riga 1 e incolla sotto per generare una nuova riga. Popola la linea 2 con campioni a seconda dell'esperimento corrente. Assicurarsi che venga utilizzata la posizione corretta nell'autocampionatore.
   6. Se la fase mobile è fresca, eseguire prima il test di forma del picco iniettando gli standard della miscela lipidica del produttore. Confronta con i risultati precedenti. ² Gli standard sono una miscela lipidica di 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (15:0-18:1 PC), lisofosfatidilcolina (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil-glicero-3-fosfoetanolammina (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-idrossi-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositolo (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadecanoil-3-ottadecenoil-sn-glicerolo (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoil-2-ottadecenoil)-sn-glicerolo (15:0-18:1 DAG), 2-ottadecenoil-sn-glicerolo (18:1 MAG), colesterolo oleato (18:1 Chol Ester).
   7. Assicurarsi che le nuove linee abbiano il metodo di separazione corretto e non il metodo di precondizionamento utilizzato nella riga 1. Assicurati che il metodo MS sia corretto (metodo del giorno corrente).
   8. Verificare che sia stato caricato il metodo di elaborazione corretto e che l'opzione Esegui processo automatizzato sia abilitata.
   9. Salvare l'elenco dei campioni per assicurarsi che i campioni vengano analizzati al termine dell'esecuzione corrente.

4. Analisi dei dati

1. Software di analisi dei dati aperti (Figura 5). Nell'angolo in alto a sinistra, fai clic sul pulsante File e seleziona Apri...
2. Seleziona i file desiderati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome del file e selezionare Proprietà.
   1. Selezionare Stato calibrazione (Figura 6). Nella casella a discesa, selezionare Calibrazione iniziale per lo spettrometro di massa. Assicurarsi che tutti gli errori siano inferiori a 1 ppm.
   2. Quindi, selezionare Calibrazione iniziale della mobilità e verificare che l'errore sia inferiore a 1 ppm.
   3. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Cromatogramma e selezionare Modifica cromatogramma (Figura 6C). In Tipo, fare clic sulla casella a discesa e selezionare Cromatogramma ionico estratto (Figura 6D). In filtro, selezionare Tutti i MS e con la modalità di scansione selezionare Tutti. Questo serve a visualizzare i picchi della molecola di interesse piuttosto che solo i suoi frammenti.
      1. Al di sotto di questo, ci sono due opzioni di filtro per la selezione delle molecole: Masse o Formula. Se si seleziona Masse , si può scegliere il m/z teorico delle molecole di interesse. In questo caso selezionare 829.7985 m/z. Se si seleziona Formula , è possibile scegliere la formula per la molecola e le forme ioniche di interesse per il cromatogramma. In questo caso, selezionare l'ammonio [M+NH₄]. Ciò è dovuto al tampone ammonio nella fase mobile che favorirà la ionizzazione in questa forma ionica (Figura 7).
      2. Per la larghezza selezionare ±1. Per la polarità, assicurarsi che mantenga la modalità positiva. In Mobilità, selezionare 1.455-1.465. Questo viene fatto per filtrare tutte le molecole che non rientrano in questi valori e isolare la molecola di interesse.
3. Una volta selezionati i parametri, fai clic su Aggiungi > OK in alto a destra. Dopo un breve periodo di tempo, il software elaborerà le selezioni e produrrà un cromatogramma.
4. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea di base all'inizio del picco di interesse e trascinare tenendo premuto fino alla fine del picco. Questa integrazione manuale fornirà uno spettro di massa in tempo reale di frammenti entro quel tempo di conservazione.
5. Mobilogramma
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sinistra dello schermo su Mobilogram e selezionare Modifica Mobilogram (Figura 8). Apparirà una finestra chiamata Modifica Tracce Mobilogramma. Seguire gli stessi passaggi da C.e.i.1 a C.e.i.5 (Figura 9).
   2. Al Tempo di Conservazione inserire il tempo di ritenzione del picco di interesse. In questo caso, 37,45-37,55 min.
   3. Una volta selezionati i parametri, fai clic su Aggiungi > OK in alto a destra. Dopo un breve periodo di tempo, il software elaborerà le selezioni e produrrà un cromatogramma.
6. Per gli ioni estratti, ripetere i passaggi 4.2.3.1-4.3.2.2 fino a formare un elenco di ioni.
7. Nella parte inferiore della finestra MS, selezionare Profilo MS e Frammento MS. Ciò consentirà una visione dello spettro degli ioni dalla scansione completa e dal PASEF.
   1. Nella vista spettro, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Copia spettri composti. Con i dati dello spettro che appaiono a destra, è possibile trovare ulteriori informazioni sul proprio composto come la risoluzione della risoluzione, la potenza di risoluzione, l'intensità e il rapporto segnale/rumore (S/N; Figura 10).
8. Elaborazione
   1. Per elaborare i dati, integrare manualmente il cromatogramma e i picchi di mobilità per ottenere informazioni preziose sulla molecola di interesse (Figura 10).
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Trova e selezionare Integra solo cromatogramma o mobilogramma (Figura 11). Fare clic con il pulsante sinistro del mouse ed evidenziare il picco desiderato. Queste informazioni includono il tempo di conservazione, l'area, il numero di serie e la mobilità.

Risultati

La marcatura degli isotopi stabili facilita la visualizzazione dei trigliceridi negli studi sulla dinamica dei lipidi delle ovaie delle zanzare femmine. Nel dominio della mobilità 2D, il trigliceride 48:1 viene visualizzato in una regione con un tempo di ritenzione specifico in relazione alla mobilità 1/K₀. L'intensità del trigliceride può essere visualizzata da una linea blu più scura. Altre macchie rappresentano trigliceridi aggiuntivi che si trovano all'interno dell'ovaio. I tempi di ritenzione e le mo...

Discussione

Nel valutare l'uso di questo protocollo, è essenziale assicurarsi che i parametri DIA-PASEF e MS/MS siano applicabili ai trigliceridi in questione. In particolare, le finestre di mobilità e la larghezza delle finestre dovrebbero seguire lo schema dei trigliceridi. Questo può essere determinato con un'esecuzione precedente utilizzando il metodo DDA. Quando si tracciano i trigliceridi nello standard interno, le finestre per la configurazione della DIA dovrebbero coprire tutte le molecole di interesse pre-identificate. L...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36