Tracciamento de novo dei lipidi mediante marcatura isotopica stabile LC-TIMS-TOF MS/MS

Riepilogo

Qui viene presentato un metodo per lo screening delle strutture lipidiche attraverso la marcatura degli isotopi stabili utilizzando il loro tempo di ritenzione, mobilità e frammentazione.

Abstract

I lipidi sono molto diversi e piccoli cambiamenti nelle strutture e nella composizione dei lipidi possono avere effetti profondi sulle funzioni biologiche critiche. La marcatura degli isotopi stabili (SIL) offre diversi vantaggi per lo studio della distribuzione, della mobilizzazione e del metabolismo dei lipidi, nonché per la sintesi de novo dei lipidi. Il successo dell'implementazione della tecnica SIL richiede la rimozione delle interferenze dalle molecole endogene. Nel presente lavoro, descriviamo un protocollo analitico ad alto rendimento per lo screening di lipidi SIL da campioni biologici; Verranno mostrati esempi di identificazione de novo lipidica durante lo sviluppo delle ovaie delle zanzare. L'uso della cromatografia liquida complementare, della spettrometria di mobilità ionica intrappolata e della spettrometria di massa consente la separazione e l'assegnazione dei lipidi da un singolo campione in un'unica scansione (<1 ora). L'approccio descritto si avvale dei recenti sviluppi nell'acquisizione dipendente dai dati e nell'acquisizione indipendente dai dati, utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità seguita dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta dalla collisione. La misurazione del SIL a livello della catena degli acidi grassi rivela cambiamenti nella dinamica dei lipidi durante lo sviluppo ovarico delle zanzare. Le strutture dei lipidi de novo vengono assegnate con sicurezza in base al tempo di ritenzione, alla mobilità e al modello di frammentazione.

Introduzione

Nell'analisi dei dati lipidici, la marcatura degli isotopi stabili (SIL) è un metodo efficace per valutare le vie metaboliche negli organismi viventi. In questo metodo, gli atomi all'interno di un analita sono sostituiti da isotopi stabili contenenti ¹³C o ²H. Questi isotopi sono ulteriormente incorporati nei precursori, che vengono successivamente incorporati negli acidi grassi, etichettando le aree in cui risiedono. Con questi isotopi, si è in grado di identificare la distribuzione e il metabolismo dei lipidi, in quanto contrasteranno con il fondo non marcato¹. Le comuni piattaforme di spettrometria di massa non sono in ....

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Dissezione degli insetti
   1. Sezionare le ovaie di zanzara Aedes aegypti quando hanno 7 giorni di vita in una soluzione salina tamponata con fosfato utilizzando microaghi.
   2. Raccogliere otto ovaie da una soluzione salina tamponata con fosfato utilizzando microaghi e conservare in provette da microcentrifuga da 1,5 ml a -80 °C.
   3. Raccogliere le ovaie in repliche biologiche.
2. Estrazione dei lipidi
   1. Aggiungere 10 μL di standard interno (ISTD) nelle otto ovaie raccolte in una concentrazione di 1 ppm. L'ISTD è una miscela lipidica marcata con sette deuterio di 1....

Discussione

Nel valutare l'uso di questo protocollo, è essenziale assicurarsi che i parametri DIA-PASEF e MS/MS siano applicabili ai trigliceridi in questione. In particolare, le finestre di mobilità e la larghezza delle finestre dovrebbero seguire lo schema dei trigliceridi. Questo può essere determinato con un'esecuzione precedente utilizzando il metodo DDA. Quando si tracciano i trigliceridi nello standard interno, le finestre per la configurazione della DIA dovrebbero coprire tutte le molecole di interesse pre-identificate. L.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36