Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

Resumo

Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.

Resumo

Os lipídios são altamente diversos e pequenas mudanças nas estruturas e composição lipídicas podem ter efeitos profundos nas funções biológicas críticas. A marcação de isótopos estáveis (SIL) oferece várias vantagens para o estudo da distribuição, mobilização e metabolismo de lipídios, bem como para a síntese lipídica de novo . A implementação bem-sucedida da técnica SIL requer a remoção de interferências de moléculas endógenas. No presente trabalho, descrevemos um protocolo analítico de alto rendimento para a triagem de lipídios SIL de amostras biológicas; Serão mostrados exemplos de identificação de lipídios de novo durante o desenvolvimento do ovário do mosquito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade de íons aprisionados e espectrometria de massa permite a separação e atribuição de lipídios de uma única amostra em uma única varredura (<1 h). A abordagem descrita aproveita os desenvolvimentos recentes na aquisição dependente de dados e aquisição independente de dados, usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. A medição do SIL no nível da cadeia de ácidos graxos revela mudanças na dinâmica lipídica durante o desenvolvimento do ovário dos mosquitos. As estruturas lipídicas de novo são atribuídas com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.

Introdução

Ao analisar dados lipídicos, a marcação de isótopos estáveis (SIL) é um método eficaz para avaliar as vias metabólicas em organismos vivos. Neste método, os átomos dentro de um analito são substituídos por isótopos estáveis contendo ¹³C ou ²H. Esses isótopos são posteriormente incorporados aos precursores, que são posteriormente incorporados aos ácidos graxos, rotulando as áreas em que residem. Com esses isótopos, é possível identificar a distribuição e o metabolismo dos lipídios, pois eles contrastarão com o fundo não rotulado¹. As plataformas comuns de espectrometria de massa não são capazes de distinguir o sinal proveni....

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Dissecção de insetos
   1. Dissecar os ovários do mosquito Aedes aegypti aos 7 dias de idade em solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas.
   2. Colete oito ovários da solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas e armazene em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a -80 ° C.
   3. Colete ovários em réplicas biológicas.
2. Extração de lipídios
   1. Adicione 10 μL de padrão interno (ISTD) nos oito ovários coletados na concentração de 1 ppm. O ISTD é uma mistura lipídica marcada com sete deutério de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:....

Discussão

Ao avaliar o uso deste protocolo, é essencial garantir que os parâmetros DIA-PASEF e MS/MS sejam aplicáveis aos triglicerídeos em questão. Especificamente, as janelas de mobilidade e a largura da janela devem seguir o padrão dos triglicerídeos. Isso pode ser determinado com uma execução anterior usando o método DDA. Ao rastrear os triglicerídeos no padrão interno, as janelas para a configuração do DIA devem cobrir todas as moléculas de interesse pré-identificadas. As janelas devem ser todas de tamanhos ig.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36