Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

Resumo

Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.

Resumo

Os lipídios são altamente diversos e pequenas mudanças nas estruturas e composição lipídicas podem ter efeitos profundos nas funções biológicas críticas. A marcação de isótopos estáveis (SIL) oferece várias vantagens para o estudo da distribuição, mobilização e metabolismo de lipídios, bem como para a síntese lipídica de novo . A implementação bem-sucedida da técnica SIL requer a remoção de interferências de moléculas endógenas. No presente trabalho, descrevemos um protocolo analítico de alto rendimento para a triagem de lipídios SIL de amostras biológicas; Serão mostrados exemplos de identificação de lipídios de novo durante o desenvolvimento do ovário do mosquito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade de íons aprisionados e espectrometria de massa permite a separação e atribuição de lipídios de uma única amostra em uma única varredura (<1 h). A abordagem descrita aproveita os desenvolvimentos recentes na aquisição dependente de dados e aquisição independente de dados, usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. A medição do SIL no nível da cadeia de ácidos graxos revela mudanças na dinâmica lipídica durante o desenvolvimento do ovário dos mosquitos. As estruturas lipídicas de novo são atribuídas com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.

Introdução

Ao analisar dados lipídicos, a marcação de isótopos estáveis (SIL) é um método eficaz para avaliar as vias metabólicas em organismos vivos. Neste método, os átomos dentro de um analito são substituídos por isótopos estáveis contendo ¹³C ou ²H. Esses isótopos são posteriormente incorporados aos precursores, que são posteriormente incorporados aos ácidos graxos, rotulando as áreas em que residem. Com esses isótopos, é possível identificar a distribuição e o metabolismo dos lipídios, pois eles contrastarão com o fundo não rotulado¹. As plataformas comuns de espectrometria de massa não são capazes de distinguir o sinal proveniente de moléculas endógenas². O sucesso do SIL requer o uso de ferramentas analíticas de ultra-alta resolução. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de mobilidade iônica aprisionada de alta resolução - espectrometria de massa sequencial de fragmentação sequencial de acumulação sequencial - tempo de voo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) permite a separação de espécies marcadas e não marcadas². A vantagem da análise LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS é que o sinal MS pode ser filtrado pelo tempo de retenção (RT) e mobilidade, reduzindo assim potenciais interferências de moléculas endógenas, bem como quantificação e separação de todas as espécies desejadas². No TIMS, um íon é primeiro mantido estacionário contra uma fase gás-móvel e posteriormente liberado de acordo com sua mobilidade. Isso fornece alta resolução Mobilogramas são gráficos de massa a carregar versus tempo de deriva que podem ser usados para distinguir entre compostos com base em seu tempo de deriva e quantidade de sobreposição⁴.

Usando uma técnica PASEF adicional, a velocidade de sequenciamento é bastante aumentada sem sacrificar a sensibilidade⁵. A teoria PASEF envolve o acúmulo de íons seguido por sua liberação sequencial na ordem de sua mobilidade. Isso é feito acumulando íons em alinhamento paralelo à sua mobilidade. O acúmulo dessa maneira evita a perda de íons. Além disso, a seleção do íon precursor ocorre simultaneamente com o acúmulo e a liberação dos íons. Com este método, o PASEF seleciona vários precursores em série durante cada varredura TIMS, em vez dos precursores individuais por varredura típicos de um instrumento TIMS que não usa PASEF. Quando os íons precursores são acumulados e liberados simultaneamente em picos de 2 ms em uma varredura TIMS de aproximadamente 100 ms por quadro, o sinal é amplificado em mais de uma ordem de magnitude, aumentando assim a relação sinal-ruído³. A adição do PASEF ao TIMS aumenta a eficiência do MS/MS. Como o TIMS-PASEF é acoplado ao MS/MS, é possível uma fragmentação mais eficiente. Ao contrário da detecção convencional de MS/MS, o sinal precursor é comprimido a partir do TIMS-PASEF e os íons fragmentos são detectados simultaneamente ao tempo de eluição do TIMS e à posição de mobilidade iônica do precursor³.

Ao adquirir dados de um espectrômetro de massa, existem opções no modo de varredura desejado. A aquisição dependente de dados (DDA) seleciona íons precursores da varredura MS1 com base em suas abundâncias, antes de fragmentá-los e realizar a varredura MS2. Este modo de varredura fragmenta o maior número possível de precursores. A abordagem DDA é direcionada e os resultados dependerão da seleção de íons³. No entanto, o DDA-PASEF frequentemente apresenta problemas na reprodutibilidade entre as repetições. Embora a DDA seja uma ótima ferramenta em uma análise focada, misturas complexas têm maior dificuldade em sua aquisição de dados⁶. Isso ocorre porque apenas uma pequena quantidade de íons pode ser monitorada simultaneamente³. A aquisição independente de dados (DIA) é um método em que as janelas pré-selecionadas de m/z são fragmentadas independentemente de sua intensidade e todas são verificadas dentro do intervalo⁷. Com este modo de varredura, nuvens de íons inteiras são transmitidas do IMS para o espectrômetro de massa³. Em estudos proteômicos, isso resulta em maiores quantidades de proteínas sendo quantificadas em um período de tempo mais curto em comparação com o DDA. Além disso, o DIA perde menos valores de m/z em comparação com o DDA. Portanto, esta alternativa mostrou grandes melhorias na reprodutibilidade dos dados na relação sinal-ruído e melhor quantificação do que o DDA. No presente trabalho, nosso objetivo é implementar a DIA ao método relatado por Tose et ^al.2. Melhoramos a reprodutibilidade e a intensidade dos sinais, produzindo informações adicionais e mais conclusivas sobre a mobilização, distribuição e metabolismo de lipídios SIL em amostras biológicas aproveitando a aquisição de DDA e DIA.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Dissecção de insetos
   1. Dissecar os ovários do mosquito Aedes aegypti aos 7 dias de idade em solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas.
   2. Colete oito ovários da solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas e armazene em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a -80 ° C.
   3. Colete ovários em réplicas biológicas.
2. Extração de lipídios
   1. Adicione 10 μL de padrão interno (ISTD) nos oito ovários coletados na concentração de 1 ppm. O ISTD é uma mistura lipídica marcada com sete deutério de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:0-18:1 (D7) PC), lisofosfatidilcolina-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoil-3-octadecenoil-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoil-2-octadeceoil)-sn-glicerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadeceoil-sn-glicerol-D7 (18:1 MAG (D7)), oleato de colesterol-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).
   2. Espere até secar à temperatura ambiente. Adicione 100 μL de butanol/metanol e 3 μL de hidroxitolueno butilado. Homogeneizar manualmente por 10 s com pilões de polipropileno de 1,5 mL.
   3. Lave o pilão com 200 μL de butanol/metanol e misture com a solução homogeneizada.
   4. Sonicar o tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente e potência média durante 30 min.
   5. Tubos de centrífuga a 1600 x g por 10 min a 20 °C. Transfira o sobrenadante para o frasco do amostrador automático com 300 μL de inserções de vidro silanizado.

2. Configuração do instrumento

1. Preparando a fase móvel
   1. Prepare a fase móvel com uma composição de 30:40:30 (fase móvel A) e 10:5:85 (fase móvel B) usando acetonitrila, água e isopropanol como respectiva proporção. Em ambas as fases móveis, adicione 10 mmol / L de formiato de amônio em água e 0,1% de ácido fórmico para criar uma condição tampão.
   2. Pesar 3,15 g de formiato de amónio em 10 ml de água. Adicione 500 μL desta solução em 12,5 mL de água. Em seguida, colocar num balão volumétrico de 250 ml e encher com isopropanol até cerca de 2/3 do balão. Misture girando.
   3. Adicione 250 μL de ácido fórmico (85%), encha com 25 mL de acetonitrila e isopropanol à linha de enchimento de 250 mL e misture.
2. No sistema MS, no lado esquerdo da tela nas configurações do MS, determine a faixa de massa selecionando 50 como o mínimo e 1850 como a configuração de varredura máxima.
   1. Selecione Polaridade como modo de íon positivo. Selecione o modo de varredura como DIA-PASEF. Para fazer isso, selecione Ajustar e abrir o método de análise de um método DDA anterior com os seguintes parâmetros LC.
      1. Para separação de gradiente:
         Injeção de amostra: 0% B, tempo de espera 1 min.
         Aumente para 55% B, segure até 6,4 min.
         Aumente para 65% B, segure até 24 min.
         Aumente para 88% B, mantenha firme até 40,8 min.
         Aumente para 95% B, segure até 48,1 min.
         Diminua para 35% B, mantenha até 56 min.
         Diminua para 0% B, mantenha firme até 60 min.
      2. Para condições de HPLC:
         Volume de injeção: 5 μL
         Taxa de solvente: 0,25 mL / min
         Tempo total de execução: 60 min, em que 5 min são para pré-condicionar a coluna.
      3. Preparar o cromatógrafo líquido inserindo a coluna no cromatógrafo líquido. Execute um espaço em branco para limpar a coluna e testar se há vazamentos. Isso pode ser visto no instrumento que não mantém pressão ou fluxo.
3. Para criar um novo método, execute as etapas descritas abaixo (Figura 1 e Figura 2).
   1. Abra o software e clique em Conectar todos os instrumentos. Se a conexão for bem-sucedida, o sistema LC emitirá um bipe e a tela de controle listará HyStar na caixa Status sem nenhuma mensagem de erro.
   2. Clique na guia Aquisição . No Navegador de Tabela de Exemplo, localize o menu suspenso de tags e selecione um método anterior.
   3. Duplique a tabela de amostra mais recente. Clique em Salvar como... e salve a nova lista de amostras com o formato: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) onde (XXXX) é um descritor curto da análise.
   4. Clique com o botão direito do mouse no método de separação e clique em Editar método. Clique em Editar método do módulo.
   5. Clique em Download. Se for bem-sucedido, o download bem-sucedido aparecerá. Feche a tela sem salvar o método.
   6. Em Configurações de MS, vá para Configurações de TIMS, selecione o início de 1/k0 em 0,70 e o final de 1/k0 em 1,85. Defina o tempo de rampa para 150 ms. Com isso, o ciclo de trabalho e a taxa de rampa são ajustados automaticamente.
   7. Na janela inferior, selecione a guia Origem . Selecione o tipo de fonte como ESI e defina o deslocamento da placa final para 800 V e o capilar para 4500 V. Verifique a caixa do nebulizador e ajuste a pressão para 4.0 bar. Ajuste o gás seco para 4.0 L/min e a temperatura seca para 250 °C.
   8. À direita da guia de origem, selecione a guia Tune. Clique na guia Sub Geral e, sob o título de transferência, verifique os seguintes parâmetros:
      Deflexão 1 delta: 70 V
      Funil 1 RF: 250 vpp
      isCID energia: 0 eV
      Funil 2 RF: 250 vpp
      RF multipolar: 500 vpp.
      1. Sob o cabeçalho da célula de colisão, verifique os seguintes parâmetros:
         Energia de colisão: 6,0 eV
         Colisão RF: 1200 vpp.
      2. Sob o título quadrupolo, certifique-se dos seguintes parâmetros:
         Energia iônica: 6 eV
         Baixa massa: 250 m/z.
      3. Na guia pré-TOF de foco, certifique-se dos seguintes parâmetros:
         Tempo de transferência: 45 μs
         Armazenamento pré-pulso: 5,0 μs.
   9. Clique na guia Subprocessamento de Processamento . Sob detecção de pico de espectro de massa, certifique-se dos seguintes parâmetros:
      Limiar absoluto: 667
      Limiar absoluto (por 100 ms AccuTime): 445.
      1. Sob detecção de pico de mobilidade, certifique-se dos seguintes parâmetros:
         Limiar absoluto: 30,00.
   10. Clique na subguia TIMS . Na guia deslocamentos, garanta os seguintes parâmetros:
       Δt1: -20 V
       Δt2: -150 V
       Δt3: 70 V
       Δt4: 150 V
       Δt5: 0 V
       Δt6: 150 V
       Célula de colisão: 300 V.
   11. À direita da guia de ajuste, clique na guia MS/MS . Na guia de íons precursores, certifique-se dos seguintes parâmetros:
       Número de rampas PASEF: 8
       Carga mínima: 1
       Carga máxima:1.
       1. Na guia de agendamento, clique em Avançado e verifique os seguintes parâmetros:
          Intensidades: 0,1500, 5000, 10000
          Repetição: 1, 10, 5, 1
          Limiar de intensidade: 1500.
       2. Na guia de exclusão ativa, verifique os seguintes parâmetros:
          Marca de seleção de exclusão ativa
          Solte após: 0,4 min.
       3. Nas configurações de energia de colisão, garanta os seguintes parâmetros:
          K0 (V-s/cm³): 0,70, 1,60
          Energia de colisão (eV): 20,00, 35,00.
       4. Nas configurações de largura de isolamento, verifique os seguintes parâmetros:
          Massa (m/z): 622, 1222
          Largura (m/z): 1,00 2,50.
   12. Configuração do DIA-PASEF: Selecione DIA-PASEF no modo de varredura de configurações do MS à esquerda. Na guia MS/MS, selecione Editor de janelas. Aqui, assegure-se dos seguintes parâmetros (Figura 3):
       Configurações da janela: Largura da massa: 50 Da; Sobreposição de massa: 0,0 Da; Calcular a partir do polígono: passos de massa; Número de janelas de mobilidade: 1.

3. Calibração

1. Calibração do instrumento (Figura 4)
   1. Na subguia Calibração , clique em m/z, selecione Tuning Mix na caixa suspensa e clique em Calibrar no canto inferior direito.
   2. Continue clicando em Calibrar até que uma pontuação de 100% seja alcançada.
   3. Agora selecione a guia Mobilidade e siga as mesmas etapas acima até que a pontuação de calibração de 100% seja atingida.
2. Curva de calibração
   1. Mistura de padrão interno de espiga lipídica com 10 μL de mistura de padrão interno deuterado.
      Use sete pontos de calibração de 0,1-500 ng/mL de mistura padrão com 10 μL da mistura de padrão interno deuterado.
   2. Anote manualmente as cadeias de ácidos graxos com base nos padrões PASEF MS / MS já descritos em².
3. Eficiência de rotulagem SIL
   1. Calcule a razão entre a área do SIL contendo isótopos e a área do isótopo não SIL
   2. Calcule o padrão teórico determinando a probabilidade de encontrar um átomo rotulado em qualquer local.
   3. Calcule o enriquecimento de SIL ajustando os perfis de isótopos experimentais com o padrão teórico simulado no software de análise de dados.
4. Iniciando a corrida
   1. Ative o forno de coluna clicando no botão Termômetro . Ative as bombas clicando no botão Válvula .
   2. Defina o método MS para o método salvo anteriormente. Verifique se o volume de injeção é de 5 μL e se a linha 1 terá como alvo o frasco 20:1.
   3. Certifique-se de que o frasco 20:1 tem 50% de IPA/ACN. Salve a lista de amostras.
   4. Inicie a sequência e verifique se uma injeção bem-sucedida foi feita (confirmada por uma mensagem exibida no sistema informando injetado).
   5. Copie a linha 1 e cole abaixo para gerar uma nova linha. Preencha a linha 2 com amostras, dependendo do experimento atual. Certifique-se de que a posição correta no amostrador automático seja usada.
   6. Se a fase móvel for recente, realize primeiro o teste de forma de pico injetando os padrões de mistura lipídica do fabricante. Compare com resultados anteriores. ² Os padrões são uma mistura lipídica de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolalina (15:0-18:1 PC), lisofosfatidilcolina (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadecanoil-3-octadecenoil-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil)-sn-glicerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadeceoil-sn-glicerol (18:1 MAG), oleato de colesterol (18:1 Chol Ester).
   7. Certifique-se de que as novas linhas tenham o método de separação correto e não o método de pré-condicionamento usado na linha 1. Certifique-se de que o método MS esteja correto (método do dia atual).
   8. Verifique se o método de processamento correto está carregado e se a opção Executar Processo Automatizado está ativada.
   9. Salve a lista de amostras para garantir que as amostras sejam analisadas após o término da execução atual.

4. Análise dos dados

1. Software de análise de dados abertos (Figura 5). No canto superior esquerdo, clique no botão Arquivo e selecione Abrir...
2. Selecione os arquivos de sua escolha. Clique com o botão direito do mouse no nome do arquivo e selecione Propriedades.
   1. Selecione Status de calibração (Figura 6). Na caixa suspensa, selecione Calibração inicial para o espectrômetro de massa. Certifique-se de que todos os erros sejam inferiores a 1 ppm.
   2. Em seguida, selecione Calibração de mobilidade inicial e confirme se o erro é inferior a 1 ppm.
   3. Clique com o botão direito do mouse em Cromatograma e selecione Editar Cromatograma (Figura 6C). Em Tipo, clique na caixa suspensa e selecione Extraído Em filtro, selecione Todos os MS e, com o modo de verificação, selecione Todos. Isso é para ver os picos da molécula de interesse, em vez de apenas seus fragmentos.
      1. Abaixo disso, existem duas opções de filtro para seleção de moléculas: Massas ou Fórmula. Se Massas for selecionado, pode-se escolher o m/z teórico das moléculas de interesse. Para este caso, selecione 829,7985 m/z. Se Fórmula for selecionada, pode-se escolher a fórmula para a molécula, bem como as formas iônicas de interesse para o cromatograma. Neste caso, selecione amônio [M+NH₄]. Isso se deve ao tampão de amônio na fase móvel que favorecerá a ionização nessa forma de íon (Figura 7).
      2. Para largura, selecione ±1. Para polaridade, certifique-se de manter o modo positivo. Em Mobilidade , selecione 1,455-1,465. Isso é feito para filtrar quaisquer moléculas que não se enquadrem nesses valores e isolar a molécula de interesse.
3. Depois que os parâmetros forem selecionados, clique em Adicionar > OK no canto superior direito. Após um curto período de tempo, o software processará as seleções e produzirá um cromatograma.
4. Clique com o botão direito do mouse na linha de base no início do pico de interesse e arraste enquanto segura até o final do pico. Essa integração manual fornecerá um espectro de massa ao vivo de fragmentos dentro desse tempo de retenção.
5. Mobilograma
   1. Clique com o botão direito do mouse à esquerda da tela em Mobilograma e selecione Editar Mobilograma (Figura 8). Uma janela chamada Editar Traços de Mobilograma aparecerá. Siga os mesmos passos C.e.i.1 a C.e.i.5 (Figura 9).
   2. Em Tempo de retenção , insira o tempo de retenção do pico de interesse. Neste caso, 37,45-37,55 min.
   3. Depois que os parâmetros forem selecionados, clique em Adicionar > OK no canto superior direito. Após um curto período de tempo, o software processará as seleções e produzirá um cromatograma.
6. Para íons extraídos, repita as etapas 4.2.3.1-4.3.2.2 até formar uma lista de íons.
7. Na parte inferior da janela MS, selecione Profile MS e Fragment MS. Isso permitirá uma visão do espectro de íons da varredura completa e PASEF.
   1. Na visualização do espectro, clique com o botão direito do mouse e selecione Copiar espectros compostos. Com os dados do espectro que aparecem à direita, pode-se encontrar mais informações sobre o composto, como resolução, poder de resolução, intensidade e relação sinal-ruído (S/N; Figura 10).
8. Processamento
   1. Para processar os dados, integre manualmente o cromatograma e os picos de mobilidade para fornecer informações valiosas sobre a molécula de interesse (Figura 10).
   2. Clique com o botão direito do mouse em Localizar e selecione Integrar somente cromatograma ou mobilograma (Figura 11). Clique com o botão esquerdo e destaque o pico desejado. Essas informações incluem tempo de retenção, área, S/R e mobilidade.

Resultados

A marcação de isótopos estáveis facilita a visualização de triglicerídeos em estudos de dinâmica lipídica de ovários de mosquitos fêmeas. No domínio da mobilidade 2D, o triglicerídeo 48:1 é exibido em uma região com um tempo de retenção específico em relação à mobilidade 1/K₀. A intensidade do triglicerídeo pode ser visualizada por uma linha azul mais escura. Outras manchas representam triglicerídeos adicionais encontrados no ovário. Os tempos de retenção e mobilidades variam devido ?...

Discussão

Ao avaliar o uso deste protocolo, é essencial garantir que os parâmetros DIA-PASEF e MS/MS sejam aplicáveis aos triglicerídeos em questão. Especificamente, as janelas de mobilidade e a largura da janela devem seguir o padrão dos triglicerídeos. Isso pode ser determinado com uma execução anterior usando o método DDA. Ao rastrear os triglicerídeos no padrão interno, as janelas para a configuração do DIA devem cobrir todas as moléculas de interesse pré-identificadas. As janelas devem ser todas de tamanhos ig...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36