Traçage de novo des lipides à l’aide du marquage des isotopes stables LC-TIMS-TOF MS/MS

Résumé

Voici une méthode de criblage des structures lipidiques par marquage d’isotopes stables en utilisant leur temps de rétention, leur mobilité et leur fragmentation.

Résumé

Les lipides sont très diversifiés, et de petits changements dans les structures et la composition des lipides peuvent avoir des effets profonds sur les fonctions biologiques critiques. Le marquage des isotopes stables (SIL) offre plusieurs avantages pour l’étude de la distribution, de la mobilisation et du métabolisme des lipides, ainsi que pour la synthèse de novo des lipides. La mise en œuvre réussie de la technique SIL nécessite l’élimination des interférences des molécules endogènes. Dans le présent travail, nous décrivons un protocole analytique à haut débit pour le criblage des lipides SIL à partir d’échantillons biologiques ; Des exemples d’identification lipidique de novo au cours du développement des ovaires des moustiques seront présentés. L’utilisation de la chromatographie en phase liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse permet la séparation et l’attribution des lipides à partir d’un seul échantillon en un seul balayage (<1 h). L’approche décrite tire parti des développements récents en matière d’acquisition dépendante des données et d’acquisition indépendante des données, en utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par la collision. La mesure de la SIL au niveau de la chaîne d’acides gras révèle des changements dans la dynamique des lipides au cours du développement ovaire des moustiques. Les structures lipidiques de novo sont attribuées avec confiance en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur modèle de fragmentation.

Introduction

Lors de l’analyse des données lipidiques, le marquage des isotopes stables (SIL) est une méthode efficace pour évaluer les voies métaboliques dans les organismes vivants. Dans cette méthode, les atomes d’un analyte sont remplacés par des isotopes stables contenant ¹³C ou ²H. Ces isotopes sont ensuite incorporés dans des précurseurs, qui sont ensuite intégrés dans les acides gras, marquant les zones dans lesquelles ils résident. Avec ces isotopes, on est en mesure d’identifier la distribution et le métabolisme des lipides, car ils contrastent avec le fond non marqué¹. Les plateformes courantes de spectrométrie de masse ne sont pas capables de distinguer le signal provenant des molécules endogènes². Le succès de SIL passe par l’utilisation d’outils analytiques à ultra-haute résolution. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de mobilité des ions piégés à haute résolution-accumulation parallèle, fragmentation séquentielle-temps de vol, spectrométrie de masse en tandem (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) permet de séparer les espèces marquées et non marquées². L’avantage de l’analyse LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS est que le signal MS peut être filtré par le temps de rétention (RT) et la mobilité, réduisant ainsi les interférences potentielles des molécules endogènes, ainsi que la quantification et la séparation de toutes les espèces souhaitées². Dans TIMS, un ion est d’abord maintenu stationnaire contre une phase gazo-mobile, puis libéré en fonction de sa mobilité. Cela permet d’obtenir des mobilogrammes haute résolution tout en fonctionnant à une tension inférieure à celle de l’instrumentation IMS³ précédente. Les mobilogrammes sont des graphiques de la masse à charge en fonction du temps de dérive qui peuvent être utilisés pour distinguer les composés en fonction de leur temps de dérive et de la quantité de chevauchement⁴.

En utilisant une technique PASEF supplémentaire, la vitesse de séquençage est considérablement augmentée sans sacrifier la sensibilité⁵. La théorie PASEF implique l’accumulation d’ions suivie de leur libération séquentielle dans l’ordre de leur mobilité. Cela se fait en accumulant des ions dans un alignement parallèle à leur mobilité. L’accumulation de cette manière empêche la perte d’ions. De plus, la sélection des ions précurseurs se produit en même temps que l’accumulation et la libération des ions. Avec cette méthode, PASEF sélectionne plusieurs précurseurs en série lors de chaque balayage TIMS, plutôt que les précurseurs individuels par balayage typiques d’un instrument TIMS qui n’utilise pas PASEF. Lorsque les ions précurseurs sont accumulés et libérés simultanément en pics de 2 ms dans le cadre d’un balayage TIMS d’environ 100 ms par trame, le signal est amplifié de plus d’un ordre de grandeur, ce qui augmente le rapport signal/bruit³. L’ajout du PASEF au TIMS augmente l’efficacité du MS/MS. Comme le TIMS-PASEF est couplé à MS/MS, une fragmentation plus efficace est possible. Contrairement à la détection MS/MS conventionnelle, le signal du précurseur est compressé à partir du TIMS-PASEF, et les ions fragmentaires sont détectés simultanément au temps d’élution TIMS et à la position de mobilité ionique du précurseur³.

Lors de l’acquisition de données à partir d’un spectromètre de masse, il existe des options dans le mode de balayage souhaité. L’acquisition dépendante des données (DDA) sélectionne les ions précurseurs du balayage MS1 en fonction de leur abondance, avant de les fragmenter et d’effectuer le balayage MS2. Ce mode d’analyse fragmente autant de précurseurs que possible. L’approche DDA est ciblée et les résultats dépendront de la sélection de l’ion³. Cependant, le DDA-PASEF présente souvent des problèmes de reproductibilité entre les répétitions. Bien que la DDA soit un excellent outil dans une analyse ciblée, les mélanges complexes ont plus de difficultés dans l’acquisition de leurs données⁶. En effet, seule une petite quantité d’ions peut être surveillée simultanément³. L’acquisition indépendante des données (DIA) est une méthode dans laquelle les fenêtres présélectionnées de m/z sont fragmentées indépendamment de leur intensité, et toutes sont balayées dans la plage⁷. Avec ce mode de balayage, des nuages d’ions entiers sont transmis de l’IMS au spectromètre^{de masse 3}. Dans les études protéomiques, cela se traduit par de plus grandes quantités de protéines quantifiées dans un laps de temps plus court par rapport à la DDA. De plus, DIA manque moins de valeurs m/z par rapport à DDA. Par conséquent, cette alternative a montré de grandes améliorations dans la reproductibilité des données dans le rapport signal sur bruit et une meilleure quantification que la DDA. Dans ce travail, notre objectif est d’appliquer la DIA à la méthode rapportée par Tose et ^al.2. Nous avons amélioré la reproductibilité et l’intensité des signaux, ce qui nous a permis d’obtenir des informations supplémentaires et plus concluantes sur la mobilisation, la distribution et le métabolisme des lipides SIL dans les échantillons biologiques, en tirant parti de l’acquisition de DDA et de DIA.

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Dissection d’insectes
   1. Disséquez les ovaires du moustique Aedes aegypti à l’âge de 7 jours dans une solution saline tamponnée au phosphate à l’aide de micro-aiguilles.
   2. Prélever huit ovaires dans une solution saline tamponnée au phosphate à l’aide de micro-aiguilles et les stocker dans des tubes à microcentrifuger de 1,5 mL à -80 °C.
   3. Prélever les ovaires en répliques biologiques.
2. Extraction des lipides
   1. Ajouter 10 μL d’étalon interne (ISTD) dans les huit ovaires prélevés à une concentration de 1 ppm. L’ISTD est un mélange lipidique marqué avec sept deutériums de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine-D7 (15:0-18:1 (D7) PC), lysophosphatidylcholine-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl-glycéro-3-phosphoéthanolamine-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oléoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadécanoyl-3-octadécénoyl-sn-glycérol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl)-sn-glycérol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadéconoyl-sn-glycérol-D7 (18:1 MAG (D7)), oléate de cholestéryle-D7 (18:1 (D7) ester de chol).
   2. Attendre qu’il soit sec à température ambiante. Ajouter 100 μL de butanol/méthanol et 3 μL d’hydroxytoluène butylé. Homogénéiser manuellement pendant 10 s avec des pilons en polypropylène de 1,5 ml.
   3. Rincez le pilon avec 200 μL de butanol/méthanol et combinez-le avec la solution homogénéisée.
   4. Sonicer le tube de microcentrifugation à température ambiante et à puissance moyenne pendant 30 min.
   5. Tubes de centrifugation à 1600 x g pendant 10 min à 20 °C. Transvaser le surnageant dans un flacon d’échantillonneur automatique contenant 300 μL d’inserts en verre silanisé.

2. Configuration de l’instrument

1. Préparation de la phase mobile
   1. Préparez la phase mobile avec une composition de 30:40:30 (phase mobile A) et 10:5:85 (phase mobile B) en utilisant de l’acétonitrile, de l’eau et de l’isopropanol dans la proportion respective. Dans les deux phases mobiles, ajouter 10 mmol/L de formiate d’ammonium dans de l’eau et 0,1 % d’acide formique pour créer une condition tampon.
   2. Peser 3,15 g de formiate d’ammonium dans 10 mL d’eau. Ajouter 500 μL de cette solution dans 12,5 mL d’eau. Dans l’ordre, mettre dans une fiole jaugée de 250 mL et remplir d’isopropanol jusqu’à environ 2/3 de la fiole. Mélanger en remuant.
   3. Ajouter 250 μL d’acide formique (85 %), remplir avec 25 mL d’acétonitrile et d’isopropanol jusqu’à la ligne de remplissage de 250 mL et mélanger.
2. Dans le système MS, sur le côté gauche de l’écran, dans les paramètres MS, déterminez la plage de masse en sélectionnant 50 comme réglage de balayage minimum et 1850 comme paramètre de balayage maximum.
   1. Sélectionnez Polarité comme mode d’ions positifs. Sélectionnez le mode de balayage DIA-PASEF. Pour ce faire, sélectionnez Régler et ouvrez la méthode d’analyse d’une méthode DDA précédente avec les paramètres LC suivants.
      1. Pour la séparation de gradient :
         Injection de l’échantillon : 0 % B, temps de maintien 1 min.
         Augmenter à 55 % de B, maintenir jusqu’à 6,4 min.
         Augmenter à 65 % de B, maintenir jusqu’à 24 min.
         Augmenter à 88 % de B, maintenir jusqu’à 40,8 min.
         Augmenter à 95 % de B, maintenir jusqu’à 48,1 min.
         Réduire à 35 % de B, maintenir jusqu’à 56 min.
         Réduire à 0% B, maintenir jusqu’à 60 min.
      2. Pour les conditions HPLC :
         Volume d’injection : 5 μL
         Taux de solvant : 0,25 mL/min
         Durée totale de fonctionnement : 60 min, dont 5 min pour préconditionner la colonne.
      3. Préparez le chromatographe liquide en insérant la colonne dans le chromatographe liquide. Exécutez une pièce blanche pour nettoyer la colonne et tester les fuites. Cela se voit dans le fait que l’instrument ne maintient pas la pression ou le débit.
3. Pour créer une méthode, effectuez les étapes décrites ci-dessous (Graphique 1 et Graphique 2).
   1. Ouvrez le logiciel et cliquez sur Connecter tous les instruments. Si la connexion réussit, le système LC émettra un bip et l’écran de contrôle répertorie HyStar dans la case d’état sans aucun message d’erreur.
   2. Cliquez sur l’onglet Acquisition . Dans le navigateur de tables d’échantillons, recherchez le menu déroulant des balises et sélectionnez une méthode précédente.
   3. Doubler le dernier tableau d’échantillons. Cliquez sur Enregistrer sous... et enregistrez une nouvelle liste d’exemples au format : YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) où (XXXX) est un descripteur court de l’analyse.
   4. Faites un clic droit sur la méthode de séparation et cliquez sur Modifier la méthode. Cliquez sur Modifier la méthode du module.
   5. Cliquez sur Télécharger. En cas de succès, le téléchargement réussi apparaîtra. Fermer l’écran sans méthode d’enregistrement.
   6. Sous Paramètres MS, allez dans les paramètres TIMS, sélectionnez le 1/k0 à partir de 0,70 et 1/k0 à 1,85. Réglez le temps de rampe sur 150 ms. Ainsi, le cycle de service et le taux de rampe sont automatiquement ajustés.
   7. Dans la fenêtre inférieure, sélectionnez l’onglet Source . Sélectionnez le type de source ESI et réglez le décalage de la plaque d’extrémité sur 800 V et le capillaire sur 4500 V. Vérifiez le boîtier du nébuliseur et réglez la pression sur 4,0 bars. Réglez le gaz sec à 4,0 L/min et la température sèche à 250 °C.
   8. À droite de l’onglet source, sélectionnez l’onglet Tune. Cliquez sur le sous-onglet Général et, sous l’en-tête de transfert, assurez-vous que les paramètres suivants sont définis :
      Déviation 1 delta : 70 V
      Entonnoir 1 RF : 250 vpp
      Énergie isCID : 0 eV
      Entonnoir 2 RF : 250 vpp
      RF multipolaire : 500 vpp.
      1. Sous l’en-tête de la cellule de collision, assurez-vous des paramètres suivants :
         Énergie de collision : 6,0 eV
         Collision RF : 1200 vpp.
      2. Sous l’en-tête quadripolaire, assurez-vous des paramètres suivants :
         Énergie ionique : 6 eV
         Faible masse : 250 m/z.
      3. Sous l’onglet focus pré-TOF, assurez-vous des paramètres suivants :
         Temps de transfert : 45 μs
         Stockage pré-impulsionnel : 5,0 μs.
   9. Cliquez sur le sous-onglet Traitement . La détection des pics sous spectres de masse garantit les paramètres suivants :
      Seuil absolu : 667
      Seuil absolu (par 100 ms AccuTime) : 445.
      1. Sous la détection des pics de mobilité, assurez-vous des paramètres suivants :
         Seuil absolu : 30,00.
   10. Cliquez sur le sous-onglet TIMS . Sous l’onglet Décalages, assurez-vous des paramètres suivants :
       Δt1 : -20 V
       Δt2 : -150 V
       Δt3 : 70 V
       Δt4 : 150 V
       Δt5 : 0 V
       Δt6 : 150 V
       Cellule de collision : 300 V.
   11. À droite de l’onglet tune, cliquez sur l’onglet MS/MS . Sous l’onglet ions précurseurs, assurez-vous des paramètres suivants :
       Nombre de rampes PASEF : 8
       Charge minimale : 1
       Charge maximale :1.
       1. Sous l’onglet Planification, cliquez sur Avancé et assurez-vous des paramètres suivants :
          Intensités : 0,1500, 5000, 10000
          Répétition : 1, 10, 5, 1
          Seuil d’intensité : 1500.
       2. Sous l’onglet d’exclusion actif, assurez-vous d’utiliser les paramètres suivants :
          Coche d’exclusion active
          Relâchement après : 0,4 min.
       3. Sous les paramètres d’énergie de collision, assurez-vous des paramètres suivants :
          K0 (V-s/cm³) : 0,70, 1,60
          Énergie de collision (eV) : 20.00, 35.00.
       4. Sous les paramètres de largeur d’isolement, assurez-vous que les paramètres suivants sont les suivants :
          Masse (m/z) : 622, 1222
          Largeur (m/z) : 1.00 2.50.
   12. Configuration DIA -PASEF : Sélectionnez DIA-PASEF dans le mode de balayage des paramètres MS sur la gauche. Sous l’onglet MS/MS, sélectionnez Éditeur de fenêtres. Ici, assurez-vous des paramètres suivants (Figure 3) :
       Paramètres de la fenêtre : Largeur de masse : 50 Da ; Chevauchement de masse : 0,0 Da ; Calculer à partir du polygone : pas de masse ; Nombre de fenêtres de mobilité : 1.

3. Calibrage

1. Étalonnage de l’instrument (Figure 4)
   1. Sous le sous-onglet Calibrage , cliquez sur m/z, sélectionnez Tuning Mix dans la liste déroulante et cliquez sur Calibrer dans le coin inférieur droit.
   2. Continuez à cliquer sur Calibrer jusqu’à ce qu’un score de 100 % soit atteint.
   3. Sélectionnez maintenant l’onglet Mobilité et suivez les mêmes étapes que ci-dessus jusqu’à ce que le score d’étalonnage de 100 % soit atteint.
2. Courbe d’étalonnage
   1. Mélange d’étalon interne de lipides de pointe avec 10 μL de mélange d’étalon interne deutéré.
      Utilisez sept points d’étalonnage de 0,1 à 500 ng/mL de mélange étalon avec 10 μL de mélange d’étalon interne deutéré.
   2. Annoter manuellement les chaînes d’acides gras sur la base des modèles PASEF MS/MS déjà décrits en².
3. Efficacité de l’étiquetage SIL
   1. Calculer le rapport entre l’aire des isotopes contenant des SIL et l’aire des isotopes ne contenant pas de SIL.
   2. Calculez le modèle théorique en déterminant la probabilité de trouver un atome marqué n’importe quel site.
   3. Calculez l’enrichissement SIL en ajustant les profils isotopiques expérimentaux avec le modèle théorique simulé sur un logiciel d’analyse de données.
4. Démarrage de la course
   1. Activez le four à colonne en cliquant sur le bouton Thermomètre . Activez les pompes en cliquant sur le bouton Valve .
   2. Définissez la méthode MS sur la méthode enregistrée précédemment. Vérifiez que le volume d’injection est de 5 μL et que la ligne 1 ciblera le flacon 20:1.
   3. Assurez-vous que le flacon 20:1 contient 50 % d’alcool isopropylique/ACN. Enregistrez la liste d’échantillons.
   4. Démarrez la séquence et vérifiez qu’une injection a réussi (confirmée par un message affiché sur le système indiquant injecté).
   5. Copiez la ligne 1 et collez-la ci-dessous pour générer une nouvelle ligne. Remplissez la ligne 2 avec des échantillons en fonction de l’expérience en cours. Assurez-vous que la position correcte dans l’échantillonneur automatique est utilisée.
   6. Si la phase mobile est fraîche, effectuez d’abord un test de forme maximale en injectant les étalons de mélange de lipides du fabricant. Comparez avec les résultats précédents. ² Il s’agit d’un mélange lipidique composé de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (15:0-18:1 PC), de lysophosphatidylcholine (18:1 Lyso PC), de 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl-glycéro-3-phosphoéthanolamine (15:0-18:1 PE), de 1-oléoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (18:1 Lyso PE), de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoinositol (15:0-18:1 PI), de 1-pentadécanoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (15:0-18:1 PS), de 1,2- dipentadécanoyl-3-octadécénoyl-sn-glycérol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadécanoyl-2-octadécénoyl)-sn-glycérol (15:0-18:1 DAG), 2-octadécénoyl-sn-glycérol (18:1 MAG), oléate de cholestéryle (18:1 ester de chol).
   7. Assurez-vous que les nouvelles lignes ont la bonne méthode de séparation et non la méthode de préconditionnement utilisée dans la ligne 1. Assurez-vous que la méthode MS est correcte (méthode du jour).
   8. Vérifiez que la méthode de traitement correcte est chargée et que l’option Exécuter le processus automatisé est activée.
   9. Enregistrez la liste d’échantillons pour vous assurer que les échantillons sont analysés une fois l’exécution en cours terminée.

4. Analyse des données

1. Logiciel d’analyse de données ouvertes (Figure 5). Dans le coin supérieur gauche, cliquez sur le bouton Fichier et sélectionnez Ouvrir...
2. Sélectionnez les fichiers de votre choix. Faites un clic droit sur le nom du fichier et sélectionnez Propriétés.
   1. Sélectionnez État de l’étalonnage (Figure 6). Dans la liste déroulante, sélectionnez Étalonnage initial pour le spectromètre de masse. Assurez-vous que toutes les erreurs sont inférieures à 1 ppm.
   2. Ensuite, sélectionnez Étalonnage initial de la mobilité et vérifiez que l’erreur est inférieure à 1 ppm.
   3. Faites un clic droit sur Chromatogramme et sélectionnez Modifier le chromatogramme (Figure 6C). Dans Type, cliquez sur la liste déroulante et sélectionnez Chromatogramme ionique extrait (Figure 6D). Sous Filtre, sélectionnez Tous les MS et, en mode de balayage, sélectionnez Tous. Il s’agit de voir les pics de la molécule d’intérêt plutôt que seulement ses fragments.
      1. En dessous, il existe deux options de filtre pour la sélection des molécules : Masses ou Formule. Si Masses est sélectionné, on peut choisir le m/z théorique des molécules d’intérêt. Pour ce cas, sélectionnez 829,7985 m/z. Si l’option Formule est sélectionnée, on peut choisir la formule de la molécule ainsi que les formes ioniques d’intérêt pour le chromatogramme. Dans ce cas, sélectionnez l’ammonium [M+NH₄]. Cela est dû au tampon d’ammonium en phase mobile qui va favoriser l’ionisation sous cette forme ionique (Figure 7).
      2. Pour la largeur, sélectionnez ±1. Pour la polarité, assurez-vous qu’il maintient le mode positif. Sous Mobilité , sélectionnez 1,455-1,465. Ceci est fait pour filtrer toutes les molécules qui ne correspondent pas à ces valeurs et isoler la molécule d’intérêt.
3. Une fois les paramètres sélectionnés, cliquez sur Ajouter > OK en haut à droite. Après un court laps de temps, le logiciel traitera les sélections et produira un chromatogramme.
4. Faites un clic droit sur la ligne de base au début du pic d’intérêt et faites-le glisser tout en maintenant jusqu’à la fin du pic. Cette intégration manuelle fournira un spectre de masse en direct de fragments dans ce temps de rétention.
5. Mobilogramme
   1. Cliquez avec le bouton droit de la souris à gauche de l’écran sur Mobilogram et sélectionnez Modifier le Mobilogramme (Figure 8). Une fenêtre nommée Modifier les traces du Mobilogramme apparaîtra. Suivez les mêmes étapes C.e.i.1 à C.e.i.5 (Figure 9).
   2. Dans Temps de rétention , entrez le temps de rétention du pic d’intérêt. Dans ce cas, 37,45-37,55 min.
   3. Une fois les paramètres sélectionnés, cliquez sur Ajouter > OK en haut à droite. Après un court laps de temps, le logiciel traitera les sélections et produira un chromatogramme.
6. Pour les ions extraits, répétez les étapes 4.2.3.1 à 4.3.2.2 jusqu’à ce qu’une liste d’ions se forme.
7. En bas de la fenêtre MS, sélectionnez Profile MS et Fragment MS. Cela permettra d’obtenir une vue spectrale des ions à partir d’un balayage complet et d’un PASEF.
   1. Dans la vue du spectre, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Copier les spectres composés. Avec les données spectrales qui apparaissent à droite, on peut trouver plus d’informations sur son composé telles que la résolution, le pouvoir de résolution, l’intensité et le rapport signal/bruit (S/N ; Figure 10).
8. Traitement
   1. Pour traiter les données, intégrez manuellement le chromatogramme et les pics de mobilité afin d’obtenir des informations précieuses sur la molécule d’intérêt (Figure 10).
   2. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Rechercher et sélectionnez Intégrer uniquement le chromatogramme ou le mobilogramme (Figure 11). Faites un clic gauche et mettez en surbrillance le pic souhaité. Ces informations comprennent le temps de rétention, la zone, le numéro de série et la mobilité.

Résultats

Le marquage des isotopes stables facilite la visualisation des triglycérides dans les études de dynamique lipidique des ovaires de moustiques femelles. Dans le domaine de la mobilité 2D, le triglycéride 48:1 est affiché dans une région avec un temps de rétention spécifique par rapport à la mobilité 1/K₀. L’intensité du triglycéride peut être visualisée par une ligne bleue plus foncée. D’autres taches représentent des triglycérides supplémentaires trouvés dans l’ovaire. Les temps de ré...

Discussion

Lors de l’évaluation de l’utilisation de ce protocole, il est essentiel de s’assurer que les paramètres DIA-PASEF et MS/MS sont applicables aux triglycérides en question. Plus précisément, les fenêtres de mobilité et la largeur de la fenêtre doivent suivre le modèle des triglycérides. Cela peut être déterminé à l’aide d’une exécution précédente à l’aide de la méthode DDA. Lors du suivi des triglycérides dans l’étalon interne, les fenêtres de mise en place de l’DIA doivent couvrir tou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36