Traçage de novo des lipides à l’aide du marquage des isotopes stables LC-TIMS-TOF MS/MS

Résumé

Voici une méthode de criblage des structures lipidiques par marquage d’isotopes stables en utilisant leur temps de rétention, leur mobilité et leur fragmentation.

Résumé

Les lipides sont très diversifiés, et de petits changements dans les structures et la composition des lipides peuvent avoir des effets profonds sur les fonctions biologiques critiques. Le marquage des isotopes stables (SIL) offre plusieurs avantages pour l’étude de la distribution, de la mobilisation et du métabolisme des lipides, ainsi que pour la synthèse de novo des lipides. La mise en œuvre réussie de la technique SIL nécessite l’élimination des interférences des molécules endogènes. Dans le présent travail, nous décrivons un protocole analytique à haut débit pour le criblage des lipides SIL à partir d’échantillons biologiques ; Des exemples d’identification lipidique de novo au cours du développement des ovaires des moustiques seront présentés. L’utilisation de la chromatographie en phase liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse permet la séparation et l’attribution des lipides à partir d’un seul échantillon en un seul balayage (<1 h). L’approche décrite tire parti des développements récents en matière d’acquisition dépendante des données et d’acquisition indépendante des données, en utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par la collision. La mesure de la SIL au niveau de la chaîne d’acides gras révèle des changements dans la dynamique des lipides au cours du développement ovaire des moustiques. Les structures lipidiques de novo sont attribuées avec confiance en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur modèle de fragmentation.

Introduction

Lors de l’analyse des données lipidiques, le marquage des isotopes stables (SIL) est une méthode efficace pour évaluer les voies métaboliques dans les organismes vivants. Dans cette méthode, les atomes d’un analyte sont remplacés par des isotopes stables contenant ¹³C ou ²H. Ces isotopes sont ensuite incorporés dans des précurseurs, qui sont ensuite intégrés dans les acides gras, marquant les zones dans lesquelles ils résident. Avec ces isotopes, on est en mesure d’identifier la distribution et le métabolisme des lipides, car ils contrastent avec le fond non marqué¹. Les plateformes courantes de spectrométrie de masse ne s....

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Dissection d’insectes
   1. Disséquez les ovaires du moustique Aedes aegypti à l’âge de 7 jours dans une solution saline tamponnée au phosphate à l’aide de micro-aiguilles.
   2. Prélever huit ovaires dans une solution saline tamponnée au phosphate à l’aide de micro-aiguilles et les stocker dans des tubes à microcentrifuger de 1,5 mL à -80 °C.
   3. Prélever les ovaires en répliques biologiques.
2. Extraction des lipides
   1. Ajouter 10 μL d’étalon interne (ISTD) dans les huit ovaires prélevés à une concentration de 1 ppm. L’ISTD est un mélange lipidique marqué avec sep....

Discussion

Lors de l’évaluation de l’utilisation de ce protocole, il est essentiel de s’assurer que les paramètres DIA-PASEF et MS/MS sont applicables aux triglycérides en question. Plus précisément, les fenêtres de mobilité et la largeur de la fenêtre doivent suivre le modèle des triglycérides. Cela peut être déterminé à l’aide d’une exécution précédente à l’aide de la méthode DDA. Lors du suivi des triglycérides dans l’étalon interne, les fenêtres de mise en place de l’DIA doivent couvrir tou.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36