מעקב אחר ליפידים של נובו באמצעות תיוג איזוטופ יציב LC-TIMS-TOF MS/MS

Summary

מוצגת כאן שיטה לסינון מבני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים באמצעות זמן השמירה, הניידות והפיצול שלהם.

Abstract

שומנים הם מגוונים מאוד, ושינויים קטנים במבנה השומנים ובהרכבם יכולים להיות בעלי השפעות עמוקות על תפקודים ביולוגיים קריטיים. תיוג איזוטופים יציבים (SIL) מציע מספר יתרונות לחקר פיזור השומנים, ניודיזציה ומטבוליזם, כמו גם סינתזת שומנים דה נובו . היישום המוצלח של טכניקת SIL דורש הסרת הפרעות ממולקולות אנדוגניות. בעבודה הנוכחית אנו מתארים פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לבדיקת שומנים SIL מדגימות ביולוגיות; יוצגו דוגמאות לזיהוי שומנים דה נובו במהלך התפתחות שחלות יתושים. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה מאפשר הפרדה והקצאת שומנים מדגימה בודדת בסריקה אחת (<1 שעות). הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישה תלוית נתונים ורכישה בלתי תלויה בנתונים, תוך שימוש בצבירה מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. מדידת SIL ברמת שרשרת חומצות השומן מגלה שינויים בדינמיקה של שומנים במהלך התפתחות השחלה של יתושים. מבני השומנים דה נובו מוקצים בביטחון בהתבסס על זמן השמירה שלהם, ניידות ודפוס הפיצול שלהם.

Introduction

בעת ניתוח נתוני שומנים, תיוג איזוטופים יציבים (SIL) הוא שיטה יעילה להערכת מסלולים מטבוליים באורגניזמים חיים. בשיטה זו, אטומים בתוך אנליט מוחלפים על ידי איזוטופים יציבים המכילים ¹³C או ²H. איזוטופים אלה משולבים עוד יותר בקודמנים, אשר מוטמעים מאוחר יותר בתוך חומצות השומן, ומסמנים את האזורים שבהם הם שוכנים. עם איזוטופים אלה, ניתן לזהות את התפלגות ומטבוליזם של שומנים, כפי שהם יהיו בניגוד לרקע ללא תווית¹. פלטפורמות ספקטרומטריית מסות נפוצות אינן מסוגלות להבחין בין האות המגיע ממולקולות אנדוגניות². ההצלחה של SIL דורשת שימוש בכלים אנליטיים ברזולוציה גבוהה במיוחד. כרומטוגרפיה נוזלית המצומדת לספקטרומטריית ניידות יונים לכודים ברזולוציה גבוהה-צבירה מקבילית, ספקטרומטריית מסה טנדם רציפה של פיצול רציף-זמן-טיסה (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) מאפשרת הפרדה בין מינים מסומנים ללא מסומנים². היתרון של ניתוח LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS הוא שניתן לסנן את אות הטרשת הנפוצה לפי זמן השמירה (RT) והניידות, ובכך להפחית הפרעות פוטנציאליות של מולקולות אנדוגניות, כמו גם כימות והפרדה של כל המינים הרצויים². ב-TIMS, יון מוחזק תחילה במצב נייח כנגד פאזה ניידת גז ולאחר מכן משוחרר בהתאם לניידות שלו. זה מספק ניידות ברזולוציה גבוהה תוך פעולה במתח נמוך יותר מאשר מכשור IMS מוקדם יותר³. מובילוגרמות הן חלקות של מסה לטעינה לעומת זמן סחף שניתן להשתמש בהן כדי להבחין בין תרכובות בהתבסס על זמן הסחף שלהן וכמות החפיפה שלהן⁴.

על ידי שימוש בטכניקת PASEF נוספת, מהירות הרצף גדלה מאוד מבלי להקריב את רגישות⁵. תאוריית PASEF כוללת הצטברות של יונים ואחריה שחרורם הרציף לפי סדר ניידותם. זה נעשה על ידי צבירת יונים ביישור מקביל לניידות שלהם. ההצטברות באופן זה מונעת אובדן יונים. יתר על כן, בחירת היונים המקדימים מתרחשת בו זמנית עם הצטברות ושחרור היונים. בשיטה זו, PASEF בוחר מבשרי סדרה מרובים במהלך כל סריקת TIMS, במקום קודמנים בודדים לכל סריקה האופייניים למכשיר TIMS שאינו משתמש ב- PASEF. כאשר היונים המקדימים מצטברים בו זמנית ומשוחררים בפסגות של 2 אלפיות השנייה בסריקת TIMS של כ-100 מילישניות לפריים, האות מוגבר ביותר מסדר גודל אחד, ובכך מגדיל את יחס האות לרעש³. תוספת PASEF ל- TIMS מגבירה את היעילות של MS/MS. מכיוון ש-TIMS-PASEF משולב עם MS/MS, פיצול יעיל יותר אפשרי. שלא כמו זיהוי MS/MS קונבנציונלי, האות המקדים נדחס מה-TIMS-PASEF, ויוני השבר מזוהים בו זמנית לזמן האלוציה של TIMS ולמיקום ניידות היונים של קודמן³.

בעת רכישת נתונים מספקטרומטר מסות, ישנן אפשרויות במצב הסריקה הרצוי. רכישה תלוית נתונים (DDA) בוחרת יונים מקדימים מסריקת MS1 בהתבסס על השפע שלהם, לפני פיצול שלהם וביצוע סריקת MS2. מצב סריקה זה מקטעים כמה שיותר סימנים מקדימים. גישת DDA ממוקדת, והתוצאות יהיו תלויות בבחירת היונים³. עם זאת, DDA-PASEF לעתים קרובות יש בעיות ביכולת השחזור בין משכפלים. בעוד DDA הוא כלי נהדר בניתוח ממוקד, תערובות מורכבות יש קושי גדול יותר ברכישת הנתונים שלהם⁶. הסיבה לכך היא שרק כמות קטנה של יונים ניתן לנטר בו זמנית³. רכישה עצמאית של נתונים (DIA) היא שיטה שבה חלונות m/z שנבחרו מראש מפוצלים בנפרד מעוצמתם, וכולם נסרקים בטווח⁷. במצב סריקה זה, ענני יונים שלמים משודרים מה-IMS לספקטרומטר המסות³. במחקרי פרוטאומיקה התוצאה היא שכמויות גדולות יותר של חלבונים מכומתות בטווח זמן קצר יותר בהשוואה ל-DDA. בנוסף, DIA מחמיץ פחות ערכי m/z בהשוואה ל- DDA. לכן, חלופה זו הראתה שיפורים גדולים ביכולת שחזור הנתונים ביחס אות לרעש וכימות טוב יותר מאשר DDA. בעבודה הנוכחית מטרתנו היא ליישם DIA בשיטה שדווחה על ידי Tose et ^al.2. שיפרנו את יכולת השחזור והעוצמה של אותות, והפקנו מידע נוסף וחד משמעי יותר על ניוד, הפצה ומטבוליזם של שומנים ב-SIL בדגימות ביולוגיות תוך ניצול רכישת DDA ו-DIA.

Protocol

1. הכנת מדגם

1. נתיחת חרקים
   1. לנתח שחלות יתוש Aedes aegypti כאשר הם בני 7 ימים בתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים.
   2. לאסוף שמונה שחלות מתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים ולאחסן בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -80°C.
   3. לאסוף שחלות בשכפולים ביולוגיים.
2. מיצוי שומנים
   1. הוסף 10 μL של תקן פנימי (ISTD) לשמונה השחלות שנאספו בריכוז של 1 ppm. ISTD היא תערובת שומנים מסומנת עם שבעה דאוטריום של 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine-D7 (15: 0-18:1 (D7) PC), lysophosphatidylcholine-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamine-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol-D7 (18:1 MAG (D7)), cholesteryl oleate-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).
   2. יש להמתין עד לייבוש בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של butanol/מתנול ו 3 μL של hydroxytoluene butylated. הומוגניזציה ידנית במשך 10 שניות עם 1.5 מ"ל פוליפרופילן מזיקים.
   3. שטפו את המזיק עם 200 מיקרוליטר בוטנול/מתנול ושלבו עם התמיסה ההומוגנית.
   4. הפעל את צינור המיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ובעוצמה בינונית למשך 30 דקות.
   5. צינורות צנטריפוגה ב 1600 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון דוגמים אוטומטי עם 300 מיקרוליטר של תוספות זכוכית סילניות.

2. הגדרת מכשירים

1. הכנת שלב המובייל
   1. הכן שלב נייד עם הרכב של 30:40:30 (שלב נייד A) ו- 10:5:85 (שלב B נייד) באמצעות אצטוניטריל, מים ואיזופרופנול כיחס המתאים. בשני השלבים הניידים, הוסף פורמט אמוניום 10 mmol / L במים ו- 0.1% חומצה פורמית כדי ליצור מצב חיץ.
   2. שוקלים 3.15 גרם של פורמט אמוניום ב 10 מ"ל של מים. הוסף 500 μL של פתרון זה ב 12.5 מ"ל של מים. ברצף, לשים לתוך בקבוק נפח 250 מ"ל ולמלא isopropanol על 2/3 של הצלוחית. מערבבים על ידי ערבול.
   3. מוסיפים 250 מיקרוליטר חומצה פורמית (85%), ממלאים ב-25 מ"ל אצטוניטריל ואיזופרופנול לקו מילוי של 250 מ"ל, ומערבבים.
2. במערכת MS, בצד שמאל של המסך בהגדרות MS, קבע את טווח המסה על ידי בחירת 50 כמינימום ו- 1850 כהגדרת הסריקה המקסימלית.
   1. בחר Polarity כמצב יונים חיובי. בחר במצב סריקה כ - DIA-PASEF. לשם כך, בחר כוונון ושיטת ניתוח פתוחה משיטת DDA קודמת עם פרמטרי LC הבאים.
      1. להפרדת מעבר צבע:
         הזרקת דגימה: 0% B, זמן המתנה 1 דקה.
         להגדיל ל-55% B, להחזיק עד 6.4 דקות.
         להגדיל ל-65% B, להחזיק עד 24 דקות.
         להגדיל ל 88% B, להחזיק עד 40.8 דקות.
         להגדיל ל-95% B, להחזיק עד 48.1 דקות.
         מנמיכים ל-35% B, מחזיקים עד 56 דקות.
         הפחיתו ל-0% B, החזיקו עד 60 דקות.
      2. עבור תנאי HPLC:
         נפח הזרקה: 5 μL
         קצב ממס: 0.25 מ"ל/דקה
         זמן פעולה כולל: 60 דקות, בהן 5 דקות הן להתנות מראש את העמודה.
      3. הכן את הכרומטוגרף הנוזלי על ידי הכנסת העמודה לכרומטוגרף הנוזלי. הפעל ריק כדי לנקות את העמודה ולבדוק אם יש נזילות. ניתן לראות זאת בכך שהמכשיר אינו מחזיק לחץ או זרימה.
3. כדי ליצור שיטה חדשה, בצע את השלבים המתוארים להלן (תרשים 1 ו תרשים 2).
   1. פתח את התוכנה ולחץ על חבר את כל המכשירים. אם החיבור מצליח, מערכת LC תצפצף פעם אחת, ומסך הבקרה מפרט את HyStar בתיבה מצב ללא הודעות שגיאה.
   2. לחץ על הכרטיסייה רכישה . ב- Sample Table Navigator, אתר את התפריט הנפתח Tag ובחר שיטה קודמת.
   3. הכפילו את טבלת הדוגמאות העדכנית ביותר. לחץ על שמירה בשם... ושמור רשימה חדשה לדוגמה עם הפורמט: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) כאשר (XXXX) הוא תיאור קצר של הניתוח.
   4. לחצו לחיצה ימנית על שיטת ההפרדה ולחצו על עריכת שיטה. לחץ על ערוך שיטת מודול.
   5. לחץ על הורד. אם תצליח, ההורדה הצליחה תופיע. סגור את המסך ללא שיטת שמירה.
   6. תחת הגדרות MS עבור אל הגדרות TIMS, בחר את 1/k0 להתחיל ב- 0.70 ו- 1/k0 להסתיים ב- 1.85. הגדר את זמן הרמפה ל- 150 אלפיות השנייה. עם זאת, מחזור העבודה ואת קצב הרמפה מותאמים באופן אוטומטי.
   7. בחלון התחתון, בחר בכרטיסיה מקור . בחר את סוג המקור כ - ESI והגדר את הסטת לוח הקצה ל- 800 V ואת הנימים ל- 4500 V. סמן את תיבת הנבולייזר והגדר את הלחץ ל- 4.0 בר. כוונו את הגז היבש ל-4.0 ליטר/דקה ואת הטמפרטורה היבשה ל-250°C.
   8. משמאל לכרטיסיית המקור, בחר בכרטיסיה כוונון. לחץ על הכרטיסיה משנה כללית ותחת כותרת ההעברה ודא את הפרמטרים הבאים:
      סטייה 1 דלתא: 70 V
      משפך 1 RF: 250 vpp
      אנרגיית isCID: 0 eV
      משפך 2 RF: 250 vpp
      RF רב-קוטבי: 500 vpp.
      1. תחת הכותרת תא התנגשות ודא את הפרמטרים הבאים:
         אנרגיית התנגשות: 6.0 eV
         התנגשות RF: 1200 vpp.
      2. תחת הכותרת quadrupole ודא את הפרמטרים הבאים:
         אנרגיית יונים: 6 eV
         משקל נמוך: 250 m/z.
      3. תחת הכרטיסייה מיקוד טרום TOF ודא את הפרמטרים הבאים:
         זמן העברה: 45 μs
         אחסון טרום פולס: 5.0 μs.
   9. לחץ על הכרטיסיה משנה עיבוד . תחת גילוי שיא ספקטרום מסה ודא את הפרמטרים הבאים:
      סף מוחלט: 667
      סף מוחלט (לכל 100 אלפיות השנייה AccuTime): 445.
      1. תחת זיהוי שיא ניידות ודא את הפרמטרים הבאים:
         סף מוחלט: 30.00.
   10. לחץ על כרטיסיית המשנה TIMS . תחת הכרטיסייה קיזוזים, ודא את הפרמטרים הבאים:
       Δt1: -20 V
       Δt2: -150 V
       Δt3: 70 V
       Δt4: 150 V
       Δt5: 0 V
       Δt6: 150 V
       תא התנגשות: 300 V.
   11. משמאל לכרטיסיית הכוונון, לחץ על הכרטיסיה MS/MS . תחת הכרטיסייה יונים מקדימים, ודא את הפרמטרים הבאים:
       מספר רמפות PASEF: 8
       מינימום טעינה: 1
       טעינה מקסימלית:1.
       1. תחת הכרטיסיה תזמון, לחץ על מתקדם וודא את הפרמטרים הבאים:
          עוצמות: 0,1500, 5000, 10000
          חזרות: 1, 10, 5, 1
          סף עצימות: 1500.
       2. תחת הכרטיסייה אי-הכללה פעילה, ודא את הפרמטרים הבאים:
          סימן ביקורת פעיל של אי-הכללה
          שחרור אחרי: 0.4 דקות
       3. תחת הגדרות אנרגיית התנגשות ודא את הפרמטרים הבאים:
          K0 (V-s/cm³): 0.70, 1.60
          אנרגיית התנגשות (eV): 20.00, 35.00.
       4. תחת הגדרות רוחב בידוד ודא את הפרמטרים הבאים:
          מסה (m/z): 622, 1222
          רוחב (m/z): 1.00 2.50.
   12. הגדרת DIA -PASEF: בחר DIA-PASEF ממצב סריקת הגדרות MS בצד שמאל. תחת הכרטיסיה MS/MS, בחר Window Editor. כאן, ודא את הפרמטרים הבאים (איור 3):
       הגדרות חלון: רוחב מסה: 50 Da; חפיפה המונית: 0.0 Da; חישוב מצולע: צעדים המוניים; מספר חלונות ניידות: 1.

3. כיול

1. כיול מכשירים (איור 4)
   1. תחת הכרטיסייה משנה כיול לחץ על m/z, בחר Tuning Mix מתיבת השחרור ולחץ כיול בפינה השמאלית התחתונה.
   2. המשך ללחוץ על כיול עד להשגת ציון של 100%.
   3. כעת בחר בכרטיסיה ניידות ובצע את אותם השלבים שתוארו לעיל עד שתגיע לציון הכיול של 100%.
2. עקומת כיול
   1. ספייק תערובת סטנדרטית פנימית של שומנים עם 10 μL של תערובת סטנדרטית פנימית מפורקת.
      השתמש בשבע נקודות כיול מ- 0.1-500 ננוגרם/מ"ל של תערובת סטנדרטית עם 10 מיקרוליטר של התערובת הסטנדרטית הפנימית המפורקת.
   2. הוסף ביאורים ידניים לשרשראות חומצות השומן המבוססות על תבניות PASEF MS/MS שכבר תוארו^ב-2.
3. יעילות התוויה SIL
   1. חשב את היחס בין שטח האיזוטופים המכילים SIL לשטח האיזוטופים שאינם מכילים SIL.
   2. חישוב הטפיחה התיאורטית על ידי קביעת ההסתברות למצוא אטום מסומן בכל אתר.
   3. חישוב העשרת SIL על ידי התאמת פרופילי האיזוטופים הניסיוניים לתבנית התיאורטית המדומה בתוכנת ניתוח נתונים.
4. התחלת הריצה
   1. הפעל תנור עמודים על ידי לחיצה על כפתור המדחום . הפעל משאבות על ידי לחיצה על כפתור שסתום .
   2. הגדר את שיטת MS לשיטה שנשמרה קודם לכן. ודא שנפח ההזרקה הוא 5 μL ושקו 1 יכוון לבקבוקון 20:1.
   3. ודא שבקבוקון 20:1 מכיל 50% IPA/ACN. שמור רשימה לדוגמה.
   4. התחל רצף וודא שבוצעה הזרקה מוצלחת (אושר על ידי הודעה המוצגת במערכת המציינת מוזרק).
   5. העתק את שורה 1 והדבק למטה כדי ליצור שורה חדשה. אכלס את קו 2 בדגימות בהתאם לניסוי הנוכחי. ודא שנעשה שימוש במיקום הנכון בדוגם האוטומטי.
   6. אם השלב הנייד טרי, בצע תחילה בדיקת צורת שיא על ידי הזרקת תקני תערובת השומנים מהיצרן. השווה עם תוצאות קודמות. ² התקנים הם תערובת שומנים של 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (15: 0-18: 1 PC), lysophosphatidylcholine (18: 1 Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamine (15: 0-18: 1 PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (18: 1 Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (15: 0-18: 1 PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (15: 0-18: 1 PS), 1,2- dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol (18:1 MAG), cholesteryl oleate (18: 1 Chol Ester).
   7. ודא שלקווים חדשים יש את שיטת ההפרדה הנכונה ולא את שיטת ההתניה מראש הנהוגה בשורה 1. ודא כי שיטת MS נכונה (השיטה של היום הנוכחי).
   8. ודא ששיטת העיבוד הנכונה נטענת ושהאפשרות הפעל תהליך אוטומטי מופעלת.
   9. שמור רשימה לדוגמה כדי לוודא שדוגמאות ינותחו לאחר סיום ההפעלה הנוכחית.

4. ניתוח נתונים

1. תוכנה פתוחה לניתוח נתונים (איור 5). בפינה השמאלית העליונה לחץ על קובץ כפתור ובחר פתח ...
2. בחר את הקבצים הנבחרים. לחץ לחיצה ימנית על שם הקובץ ובחר מאפיינים.
   1. בחר מצב כיול (איור 6). בתיבה הנפתחת, בחר כיול ראשוני עבור ספקטרומטר המסות. ודא שכל השגיאות קטנות מ- 1 עמודים לדקה.
   2. לאחר מכן, בחר כיול ניידות ראשוני ואשר שהשגיאה קטנה מ- 1 עמודים לדקה.
   3. לחץ לחיצה ימנית על כרומטוגרמה ובחר ערוך כרומטוגרמה (איור 6C). תחת סוג, לחץ על התיבה הנפתחת ובחר כרומטוגרמה של יונים שחולצו (איור 6D). תחת סינון, בחר כל MS ובמצב סריקה בחר הכל. זאת כדי לראות את הפסגות של המולקולה המעניינת ולא רק את השברים שלה.
      1. מתחת לזה, יש שתי אפשרויות סינון לבחירת מולקולות: מסות או נוסחה. אם בוחרים מסות , אפשר לבחור את ה-m/z התיאורטי של המולקולות המעניינות. במקרה זה, בחר 829.7985 m/z. אם נבחרה פורמולה , ניתן לבחור את הנוסחה עבור המולקולה, כמו גם את צורות היונים המעניינות את הכרומטוגרמה. במקרה זה, בחר אמוניום [M+NH₄]. הסיבה לכך היא חיץ האמוניום בשלב הנייד שיעדיף יינון בצורת יונים זו (איור 7).
      2. בתיבה width, בחר ±1. עבור קוטביות להבטיח כי הוא שומר על מצב חיובי. תחת ניידות, בחר 1.455-1.465. זה נעשה כדי לסנן את כל המולקולות שאינן נופלות בתוך ערכים אלה ולבודד את המולקולה של עניין.
3. לאחר בחירת הפרמטרים, לחץ על הוסף > אישור בפינה השמאלית העליונה. לאחר פרק זמן קצר, התוכנה תעבד את הבחירות ותפיק כרומטוגרמה.
4. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קו הבסיס בתחילת שיא העניין וגרור תוך כדי החזקה לסוף הפסגה. אינטגרציה ידנית זו תספק ספקטרום מסה חי של מקטעים בתוך זמן שמירה זה.
5. מובילוגרמה
   1. לחץ לחיצה ימנית בצד שמאל של המסך ב - Mobilogram ובחר Edit Mobilogram (איור 8). יופיע חלון בשם Edit Mobilogram Traces. בצעו את אותם השלבים C.e.i.1 עד C.e.i.5 (איור 9).
   2. בזמן השמירה הזן את זמן השמירה של שיא הריבית. במקרה זה, 37.45-37.55 דקות.
   3. לאחר בחירת הפרמטרים, לחץ על הוסף > אישור בפינה השמאלית העליונה. לאחר פרק זמן קצר, התוכנה תעבד את הבחירות ותפיק כרומטוגרמה.
6. עבור יונים שחולצו, חזור על שלבים 4.2.3.1-4.3.2.2 עד ליצירת רשימה של יונים.
7. בחלק התחתון של חלון MS, בחר פרופיל MS ו פרגמנט MS. זה יאפשר מבט ספקטרום של יונים מסריקה מלאה ו- PASEF.
   1. בתצוגת ספקטרום, לחץ לחיצה ימנית ובחר העתק ספקטרום מורכב. בעזרת נתוני הספקטרום המופיעים מימין, ניתן למצוא מידע נוסף על התרכובת כגון רזולוציה המספקת עוצמה, עוצמה ויחס אות לרעש (S/N; איור 10).
8. עיבוד
   1. כדי לעבד את הנתונים, שלבו ידנית את שיאי הכרומטוגרמה והניידות כדי להפיק מידע רב ערך על המולקולה המעניינת (איור 10).
   2. לחץ לחיצה ימנית על חפש ובחר שלב רק כרומטוגרמה או ניידות (איור 11). לחץ לחיצה שמאלית וסמן את הפסגה הרצויה. מידע זה כולל זמן שמירה, אזור, S/N וניידות.

תוצאות

תיוג האיזוטופ היציב מאפשר הדמיה של טריגליצרידים במחקרי דינמיקת שומנים של שחלות יתושים נקבות. בתחום הניידות הדו-ממדית, הטריגליצרידים 48:1 מוצגים באזור עם זמן שמירה ספציפי ביחס לניידות 1/K₀. את עוצמת הטריגליצרידים ניתן לדמיין על ידי קו כחול כהה יותר. כתמים אחרים מייצגים טריגליצרידים נוס?...

Discussion

בעת הערכת השימוש בפרוטוקול זה, חיוני לוודא שהפרמטרים DIA-PASEF ו- MS/MS ישימים לטריגליצרידים המדוברים. באופן ספציפי, חלונות ניידות רוחב החלון צריך לעקוב אחר דפוס של טריגליצרידים. ניתן לקבוע זאת באמצעות הפעלה קודמת בשיטת DDA. בעת מעקב אחר הטריגליצרידים בתקן הפנימי, החלונות להגדרת DIA צריכים לכסות את...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36