安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

要約

ここでは、安定同位体標識により、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションを利用した脂質構造をスクリーニングする方法を紹介します。

要約

脂質は非常に多様であり、脂質の構造と組成のわずかな変化は、重要な生物学的機能に大きな影響を与える可能性があります。安定同位体標識(SIL)は、脂質の分布、動員、代謝、 およびde novo 脂質合成の研究にいくつかの利点を提供します。SIL技術を成功裏に実装するには、内因性分子からの干渉の除去が必要です。本研究では、生体サンプルからSIL脂質をスクリーニングするためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。蚊の卵巣発育中の脂質 de novo 同定の例を示します。補完的な液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティー分析、および質量分析を使用すると、1回のスキャン(<1時間)で1つのサンプルから分離および脂質の割り当てが可能になります。ここで説明するアプローチは、データ依存型取得とデータ非依存型取得の最近の開発を利用しており、移動度トラップでの並列蓄積とそれに続く逐次フラグメンテーションと衝突による解離を使用します。脂肪酸鎖レベルでのSILの測定により、蚊の卵巣発育中の脂質動態の変化が明らかになります。脂質 de novo 構造は、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションパターンに基づいて自信を持って割り当てられます。

概要

脂質データを分析する場合、安定同位体標識(SIL)は、生体内の代謝経路を評価するための効果的な方法です。この方法では、分析種内の原子を ¹³Cまたは ²Hを含む安定同位体で置換します。これらの同位体はさらに前駆体に組み込まれ、後で脂肪酸に埋め込まれ、それらが存在する領域にラベルが付けられます。これらの同位体を使用すると、脂質の分布と代謝を特定することができます。脂質は、ラベルのない背景¹と対照的です。一般的な質量分析プラットフォームでは、内因性分子からのシグナルを区別することができません²。SILを成功させるには、超高分解能分析ツールの使用が必要です。高分解能のトラップイオンモビリティー分光法-並列蓄積シーケンシャルフラグメンテーション飛行時間型タンデム質量分析(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーにより、標識分子種と非標識分子種の分離が可能になります²。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析の利点は、MS シグナルを保持時間(RT)と移動度でフィルタリングできるため、内因性分子の潜在的な干渉を減らすことができるだけでなく、必要なすべての分子種の定量と分離できることです²。TIMSでは、イオンは最初にガス移動相に対して静止したままになり、....

プロトコル

1. サンプル調製

1. 昆虫の解剖
   1. Aedes aegypti蚊の卵巣を生後7日で、マイクロニードルを使用してリン酸緩衝生理食塩水で解剖します。
   2. リン酸緩衝生理食塩水からマイクロニードルを使用して8つの卵巣を採取し、-80°Cで1.5 mLの微量遠心チューブに保存します。
   3. 生物学的複製物で卵巣を採取します。
2. 脂質抽出
   1. 10 μL の内部標準物質 (ISTD) を 1 ppm の濃度で採取した 8 つの卵巣に加えます。ISTDは、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン-D7(15:)の7つの重水素を含む標識脂質混合物です。 0-18:1(D7)PC)、リゾホスファチジルコリン-D7(18:1(D7)Lyso PC)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(15:0-18:1(D7)PE)、1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(18:1(D7)Lyso PE)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール-D7(15:0-18:1(D7)PI)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン-D7(15:0-18:1 (D7) PS)、1,2-ジペンタデカノイル-3-オク....

結果

安定同位体標識は、雌の蚊の卵巣の脂質動態研究におけるトリグリセリドの可視化を容易にします。2D移動度ドメインでは、トリグリセリド48:1は、移動度1 / K₀に対して特定の保持時間を持つ領域に表示されます。トリグリセリドの強度は、濃い青色の線で視覚化できます。他の斑点は、卵巣内に見られる追加のトリグリセリドを表しています。保持時間と移動性は、質量と構造の違?.......

ディスカッション

このプロトコルの使用を評価する際には、DIA-PASEFおよびMS/MSパラメータが問題のトリグリセリドに適用可能であることを確認することが不可欠です。具体的には、モビリティウィンドウとウィンドウ幅はトリグリセリドのパターンに従う必要があります。これは、DDA メソッドを使用して前回の実行で決定できます。内部標準でトリグリセリドを追跡する場合、DIAセットアップのウィンドウは?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36