安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

要約

ここでは、安定同位体標識により、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションを利用した脂質構造をスクリーニングする方法を紹介します。

要約

脂質は非常に多様であり、脂質の構造と組成のわずかな変化は、重要な生物学的機能に大きな影響を与える可能性があります。安定同位体標識(SIL)は、脂質の分布、動員、代謝、 およびde novo 脂質合成の研究にいくつかの利点を提供します。SIL技術を成功裏に実装するには、内因性分子からの干渉の除去が必要です。本研究では、生体サンプルからSIL脂質をスクリーニングするためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。蚊の卵巣発育中の脂質 de novo 同定の例を示します。補完的な液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティー分析、および質量分析を使用すると、1回のスキャン(<1時間)で1つのサンプルから分離および脂質の割り当てが可能になります。ここで説明するアプローチは、データ依存型取得とデータ非依存型取得の最近の開発を利用しており、移動度トラップでの並列蓄積とそれに続く逐次フラグメンテーションと衝突による解離を使用します。脂肪酸鎖レベルでのSILの測定により、蚊の卵巣発育中の脂質動態の変化が明らかになります。脂質 de novo 構造は、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションパターンに基づいて自信を持って割り当てられます。

概要

脂質データを分析する場合、安定同位体標識(SIL)は、生体内の代謝経路を評価するための効果的な方法です。この方法では、分析種内の原子を ¹³Cまたは ²Hを含む安定同位体で置換します。これらの同位体はさらに前駆体に組み込まれ、後で脂肪酸に埋め込まれ、それらが存在する領域にラベルが付けられます。これらの同位体を使用すると、脂質の分布と代謝を特定することができます。脂質は、ラベルのない背景¹と対照的です。一般的な質量分析プラットフォームでは、内因性分子からのシグナルを区別することができません²。SILを成功させるには、超高分解能分析ツールの使用が必要です。高分解能のトラップイオンモビリティー分光法-並列蓄積シーケンシャルフラグメンテーション飛行時間型タンデム質量分析(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーにより、標識分子種と非標識分子種の分離が可能になります²。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析の利点は、MS シグナルを保持時間(RT)と移動度でフィルタリングできるため、内因性分子の潜在的な干渉を減らすことができるだけでなく、必要なすべての分子種の定量と分離できることです²。TIMSでは、イオンは最初にガス移動相に対して静止したままになり、その後、その移動度に応じて放出されます。これにより、以前のIMS計^装3よりも低い電圧で動作しながら、高解像度のモビログラムが得られます。モビログラムは、電荷する質量とドリフト時間のプロットであり、ドリフト時間とオーバーラップの量に基づいて化合物を区別するために使用できます⁴。

追加のPASEF技術を使用することで^、感度5を犠牲にすることなく、シーケンシング速度が大幅に向上します。PASEF理論では、イオンが蓄積し、その後、移動度の順に順次放出されます。これは、イオンをその移動度に平行に整列させて蓄積することによって行われます。このように蓄積することで、イオンロスを防ぎます。さらに、プリカーサーイオンの選択は、イオンの蓄積と放出と同時に行われます。この方法では、PASEFは、PASEFを使用しないTIMS装置に典型的なスキャンごとの個々の前駆体ではなく、各TIMSスキャン中に複数の前駆体を直列に選択します。フレームあたり約100 msのTIMSスキャンで、プリカーサーイオンが2 msのピークで同時に蓄積および放出されると、シグナルは1桁以上増幅されるため、S/N比^{が増加します3}。TIMSにPASEFを追加すると、MS/MSの効率が向上します。TIMS-PASEFはMS/MSと結合されているため、より効率的なフラグメンテーションが可能です。従来のMS/MS検出とは異なり、TIMS-PASEFからプリカーサーシグナルを圧縮し、プリカー^サー3のTIMS溶出時間およびイオン移動度位置にフラグメントイオンを同時に検出します。

質量分析計からデータを取得する場合、必要なスキャンモードのオプションがあります。データ依存性取得(DDA)は、MS1スキャンから存在量に基づいてプリカーサーイオンを選択し、その後、プリカーサーイオンを断片化してMS2スキャンを実行します。このスキャンモードは、できるだけ多くの前駆体をフラグメント化します。DDAアプローチはターゲットを絞っており、結果はイオン選択^{によって異なります3}。しかし、DDA-PASEFは、反復間の再現性に問題が生じることがよくあります。DDAは焦点を絞った分析に最適なツールですが、複雑な混合物はデータ取得がより困難になります⁶。これは、同時に監視できるイオンが少量しかないためです³。データ独立集録(DIA)は、事前に選択されたm/zのウィンドウを強度とは無関係に断片化し、すべてを範囲⁷内でスキャンする方法です。このスキャンモードでは、イオン雲全体がIMSから質量分析計³に送信されます。プロテオミクス研究では、DDAと比較して、より短い時間でより多くのタンパク質を定量することができます。さらに、DIAはDDAと比較してm/z値の欠落が少なくなっています。したがって、この代替案は、DDAよりもS/N比のデータの再現性が大幅に向上し、定量化が優れていることを示しています。この本研究では、Tose et ^al.2によって報告された方法にDIAを実装することを目標としています。シグナルの再現性と強度を向上させ、DDAおよびDIA取得を活用して、生体サンプル中のSIL脂質の動員、分布、代謝に関する決定的な情報をますます得ることができました。

プロトコル

1. サンプル調製

1. 昆虫の解剖
   1. Aedes aegypti蚊の卵巣を生後7日で、マイクロニードルを使用してリン酸緩衝生理食塩水で解剖します。
   2. リン酸緩衝生理食塩水からマイクロニードルを使用して8つの卵巣を採取し、-80°Cで1.5 mLの微量遠心チューブに保存します。
   3. 生物学的複製物で卵巣を採取します。
2. 脂質抽出
   1. 10 μL の内部標準物質 (ISTD) を 1 ppm の濃度で採取した 8 つの卵巣に加えます。ISTDは、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン-D7(15:)の7つの重水素を含む標識脂質混合物です。 0-18:1(D7)PC)、リゾホスファチジルコリン-D7(18:1(D7)Lyso PC)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(15:0-18:1(D7)PE)、1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-D7(18:1(D7)Lyso PE)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール-D7(15:0-18:1(D7)PI)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン-D7(15:0-18:1 (D7) PS)、1,2-ジペンタデカノイル-3-オクタデセノイル-sn-グリセロール (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル)-sn-グリセロール-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG)、2-オクタデセノイル-sn-グリセロール-D7 (18:1 MAG (D7))、オレイン酸コレステリル-D7 (18:1 (D7) チョルエステル)。
   2. 室温で乾くまで待ちます。100 μLのブタノール/メタノールと3 μLのブチル化ヒドロキシトルエンを加えます。1.5 mLのポリプロピレン製乳棒で10秒間、手作業で均質化します。
   3. 乳棒を200μLのブタノール/メタノールですすぎ、均質化した溶液と混ぜ合わせます。
   4. マイクロ遠心チューブを室温および中出力で30分間超音波処理します。
   5. チューブを1600 x g で20°Cで10分間遠心分離します。 上清を300 μLのシラン化ガラスインサートでオートサンプラーバイアルに移します。

2. 機器のセットアップ

1. 移動相の準備
   1. アセトニトリル、水、イソプロパノールをそれぞれの割合として使用して、30:40:30(移動相 A)と 10:5:85(移動相 B)の組成で移動相を調製します。両方の移動相で、10 mmol/L ギ酸アンモニウムを水と 0.1% ギ酸に添加して緩衝条件を作成します。
   2. 3.15 gのギ酸アンモニウムを10 mLの水で秤量します。この溶液500μLを12.5mLの水に加えます。順番に、250mLメスフラスコに入れ、フラスコの約2/3までイソプロパノールを充填します。渦を巻いて混ぜます。
   3. 250 μL のギ酸 (85%) を加え、250 mL の充填ラインに 25 mL のアセトニトリルとイソプロパノールを充填し、混合します。
2. MSシステムでは、画面の左側にあるMS設定で、最小スキャン設定として50を選択し、最大スキャン設定として1850を選択して、質量範囲を決定します。
   1. ポジティブイオンモードとして 極性 を選択します。スキャンモードを DIA-PASEFとして選択します。これを行うには、[ Tune and open analysis method from a previous DDA method with the following LC parameters]を選択します。
      1. グラジエント分離の場合:
         サンプル注入:0% B、保持時間1分
         55%Bに増やし、6.4分まで保持します。
         Bを65%に増やし、24分間保持します。
         88%Bに増やし、40.8分まで保持します。
         95%Bに増やし、48.1分まで保持します。
         Bを35%に減らし、56分まで保持します。
         0%Bに減らし、60分まで保持します。
      2. HPLC条件の場合:
         注入量:5 μL
         溶媒速度:0.25 mL/min
         合計実行時間: 60 分で、そのうち 5 分はカラムの前処理を行います。
      3. 液体クロマトグラフにカラムを挿入して、液体クロマトグラフを調製します。ダミーを使用してカラムをクリーニングし、漏れがないかテストします。これは、機器が圧力や流れを保持していないことに見られます。
3. 新しいメソッドを作成するには、以下で説明する手順を実行します (図 1 そして 図 2).
   1. ソフトウェアを開き、[ すべての機器を接続]をクリックします。接続が成功すると、LCシステムはビープ音を1回鳴らし、制御画面のStatusボックスにHyStarが表示され、エラーメッセージは表示されません。
   2. 「Acquisition」タブをクリックします。サンプルテーブルナビゲータで、タグドロップダウンメニューを見つけ、前の方法を選択します。
   3. 最新のサンプルテーブルを2倍にします。 「Save As... 」をクリックし、新しいサンプルリストを次の形式で保存します。YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) は分析の短い記述子です。
   4. 分離方法を右クリックし、[ Edit Method]をクリックします。 「Edit Module Method」をクリックします。
   5. 「ダウンロード」をクリックします。成功すると、[ダウンロードに成功しました]がポップアップ表示されます。保存せずに画面を閉じます。
   6. [MS 設定] で [TIMS 設定] に移動し、0.70 の 1/k0 開始と 1.85 の 1/k0 終了を選択します。ランプ時間を 150 ミリ秒に設定します。これにより、デューティサイクルとランプレートが自動的に調整されます。
   7. 下部のウィンドウで、[ ソース ]タブを選択します。ソースタイプを ESI として選択し、エンドプレートオフセットを800Vに、キャピラリーを4500Vに設定します。乾燥ガスを4.0 L / minに、乾燥温度を250°Cに設定します。
   8. ソースタブの右側にある「Tune」タブを選択します。 「一般 サブ」タブをクリックし、転送見出しの下で次のパラメータを確認します。
      たわみ1デルタ:70 V
      ファネル1 RF:250 vpp
      isCIDエネルギー:0 eV
      ファネル2 RF:250 vpp
      多極RF:500 vpp。
      1. 衝突セルの見出しの下で、次のパラメータを確認します。
         衝突エネルギー:6.0 eV
         衝突RF:1200 vpp。
      2. 四重極の見出しの下で、次のパラメータを確認してください。
         イオンエネルギー:6 eV
         低質量:250 m/z。
      3. フォーカスが合っているPre-TOFタブで、次のパラメータを確認します。
         転送時間:45μs
         プレパルス保存:5.0μs。
   9. 「Processing Sub」タブをクリックします。質量スペクトルピーク検出では、以下のパラメータを確認してください。
      絶対しきい値: 667
      絶対しきい値 (100 ミリ秒 AccuTime あたり): 445。
      1. 移動度ピーク検出では、次のパラメータを確認してください。
         絶対しきい値: 30.00。
   10. 「TIMS」サブタブをクリックします。「offsets」タブで、次のパラメータを確認します。
       Δt1:-20V
       Δt2:-150V
       Δt3:70V
       Δt4:150V
       Δt5:0V
       Δt6:150V
       コリジョンセル:300 V。
   11. 「tune」タブの右側にある「 MS/MS 」タブをクリックします。[プリカーサーイオン]タブで、次のパラメーターを確認します。
       PASEFランプの数:8
       最小充電:1
       最大充電:1。
       1. 「スケジューリング」タブで、「 詳細 」をクリックし、次のパラメータを確認します。
          強度:0,1500、5000、10000
          繰り返し:1、10、5、1
          強度しきい値: 1500。
       2. 「アクティブな除外」タブで、次のパラメータを確認します。
          アクティブな除外チェック マーク
          リリース時間後:0.4分
       3. 衝突エネルギー設定では、次のパラメータを確認してください。
          K0(V-s / cm³):0.70、1.60
          衝突エネルギー(eV):20.00、35.00。
       4. [独立性の幅] 設定で、次のパラメーターを確認します。
          質量(m / z):622、1222
          幅(m / z):1.00 2.50。
   12. DIA -PASEFのセットアップ:左側のMS設定スキャンモードから DIA-PASEF を選択します。[MS/MS] タブで、[ ウィンドウ エディタ] を選択します。ここでは、次のパラメータを確認します(図3)。
       ウィンドウ設定:質量幅:50 Da;質量オーバーラップ:0.0 Da;ポリゴンから計算します:マスステップ。移動ウィンドウの数:1。

3. キャリブレーション

1. 機器のキャリブレーション(図4)
   1. [Calibration]サブタブで[m / z]をクリックし、ドロップボックスから[Tuning Mix]を選択して、右下隅にある[Calibrate]をクリックします。
   2. スコアが 100% に達するまで [調整] をクリックし続けます。
   3. 次に、[ モビリティ ]タブを選択し、100%のキャリブレーションスコアに達するまで上記と同じ手順に従います。
2. 検量線
   1. 10 μL の重水素化内部標準混合物を含む脂質内部標準混合物をスパイクします。
      0.1〜500 ng/mLの標準混合物と10 μLの重水素化内部標準混合物から7つのキャリブレーションポイントを使用します。
   2. ²で既に説明したPASEF MS/MSパターンに基づいて脂肪酸鎖に手動でアノテーションします。
3. SILラベリング効率
   1. 同位体を含むSILの面積と同位体を含まないSILの面積の比を計算します。
   2. 任意のサイトで標識された原子を見つける確率を決定することにより、理論的なパターンを計算します。
   3. 実験用同位体プロファイルをデータ解析ソフトウェアでシミュレーションされた理論パターンに適合させることにより、SIL濃縮を計算します。
4. 実行の開始
   1. カラムオーブンをアクティブにするには、[ 温度計 ]ボタンをクリックします。 [バルブ ]ボタンをクリックしてポンプをアクティブにします。
   2. MS メソッドを、以前に保存したメソッドに設定します。注入量が 5 μL で、ライン 1 がバイアル 20:1 をターゲットとしていることを確認します。
   3. バイアル20:1に50%のIPA / ACNがあることを確認してください。サンプルリストを保存します。
   4. シーケンスを開始し、挿入が成功したことを確認します (挿入されたことを示すメッセージがシステムに表示されることで確認されます)。
   5. 行 1 をコピーし、下に貼り付けて新しい行を生成します。2行目に、現在の実験に応じたサンプルを入力します。オートサンプラーの正しい位置が使用されていることを確認してください。
   6. 移動相が新鮮な場合は、まずメーカーから提供された脂質混合物のスタンダードを注入してピーク形状試験を実施します。以前の結果と比較します。² 標準試料は、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(15:0-18:1 PC)、リゾホスファチジルコリン(18:1 Lyso PC)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(15:0-18:1 PE)、1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1 Lyso PE)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール(15:0-18:1 PI)、1-ペンタデカノイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(15:0-18:1 PS)、1,2-ジペンタデカノイル-3-オクタデセノイル-sn-グリセロール(15:0-18:1-15:0 TAG)、1-ペンタデカノイル-2-オクタデセノイル)-sn-グリセロール(15:0-18:1 DAG)、2-オクタデセノイル-sn-グリセロール(18:1 MAG)、オレイン酸コレステリル(18:1 Chol Ester)。
   7. 新しいラインの分離方法が正しいこと、およびライン 1 で使用した前処理方法ではないことを確認します。MSメソッドが正しいことを確認します(当日のメソッド)。
   8. 正しい処理方法がロードされていること、および 「自動化プロセスの実行 」が有効になっていることを確認します。
   9. サンプルリストを保存して、現在の実行の終了後にサンプルが分析されるようにします。

4. データ分析

1. Open Data Analysis ソフトウェア(図5)。左上隅にある [ファイル ]ボタンをクリックし、[ 開く]を選択します...
2. 選択したファイルを選択します。ファイル名を右クリックして、[ プロパティ]を選択します。
   1. [Calibration Status]を選択します(図6)。ドロップダウンボックスで、質量分析計の[Initial Calibration]を選択します。すべてのエラーが 1 ppm 未満であることを確認してください。
   2. 次に、[ Initial Mobility Calibration ]を選択し、エラーが1 ppm未満であることを確認します。
   3. [クロマトグラム]を右クリックし、[クロマトグラムの編集]を選択します(図 6C)。[Type]でドロップダウンボックスをクリックし、[Extracted Ion Chromatogram]を選択します(図 6D)。フィルターで「すべてのMS」を選択し、スキャンモードで「すべて」を選択します。これは、目的の分子のフラグメントだけでなく、そのピークを表示するためです。
      1. この下に、分子選択のための2つのフィルターオプションがあります:質量またはフォーミュラ。 「質量 」を選択すると、対象の分子の理論上のm/zを選択できます。この場合は、829.7985 m/z を選択します。 Formula を選択すると、分子のフォーミュラとクロマトグラムの対象となるイオン形態を選択できます。この場合、アンモニウム[M+NH₄]を選択します。これは、移動相のアンモニウムバッファーがこのイオン形態でのイオン化を促進するためです(図7)。
      2. 幅には ±1 を選択します。極性については、ポジティブモードを維持していることを確認してください。 [モビリティ ] で [1.455-1.465 ] を選択します。これは、これらの値に該当しない分子を除外し、目的の分子を分離するために行われます。
3. パラメータを選択したら、右上の [追加]>[OK ]をクリックします。しばらくすると、ソフトウェアは選択を処理し、クロマトグラムを出力します。
4. 対象のピークの始点の基線で右クリックし、ピークの終点まで押したままドラッグします。この手動統合により、その保持時間内にフラグメントのライブ質量スペクトルが得られます。
5. モビログラム
   1. Mobilogramの画面左側を右クリックし、[Edit Mobilogram]を選択します(図8)。Edit Mobilogram Traces という名前のウィンドウが表示されます。C.e.i.1からC.e.i.5まで、同じ手順に従います(図9)。
   2. At Retention Timeに、対象ピークの保持時間を入力します。この場合、37.45-37.55分。
   3. パラメータを選択したら、右上の [追加]>[OK ]をクリックします。しばらくすると、ソフトウェアは選択を処理し、クロマトグラムを出力します。
6. 抽出されたイオンについては、イオンのリストが形成されるまで手順4.2.3.1〜4.3.2.2を繰り返します。
7. MS ウィンドウの下部で、[ Profile MS ] と [Fragment MS] を選択します。これにより、フルスキャンとPASEFからのイオンのスペクトル表示が可能になります。
   1. スペクトル表示で、右クリックして「 Copy Compound Spectra」を選択します。右側に表示されるスペクトルデータを使用すると、分解能分解能、強度、信号対雑音比(S/N; 図 10)。
8. 加工
   1. データを処理するには、クロマトグラムと移動度ピークを手動で波形解析して、目的の分子に関する貴重な情報を得ることができます(図 10)。
   2. [Find]を右クリックし、[Integrate Only chromatogram]または[Mobilogram]を選択します(図 11)。左クリックして、目的のピークをハイライトします。この情報には、保持時間、面積、S/N、移動性が含まれます。

結果

安定同位体標識は、雌の蚊の卵巣の脂質動態研究におけるトリグリセリドの可視化を容易にします。2D移動度ドメインでは、トリグリセリド48:1は、移動度1 / K₀に対して特定の保持時間を持つ領域に表示されます。トリグリセリドの強度は、濃い青色の線で視覚化できます。他の斑点は、卵巣内に見られる追加のトリグリセリドを表しています。保持時間と移動性は、質量と構造の違?...

ディスカッション

このプロトコルの使用を評価する際には、DIA-PASEFおよびMS/MSパラメータが問題のトリグリセリドに適用可能であることを確認することが不可欠です。具体的には、モビリティウィンドウとウィンドウ幅はトリグリセリドのパターンに従う必要があります。これは、DDA メソッドを使用して前回の実行で決定できます。内部標準でトリグリセリドを追跡する場合、DIAセットアップのウィンドウは?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36