안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적

요약

여기에는 머무름 시간, 이동성 및 단편화를 사용하여 안정 동위원소 라벨링을 통해 지질 구조를 스크리닝하는 방법이 제시되어 있습니다.

초록

지질은 매우 다양하며, 지질 구조와 구성의 작은 변화도 중요한 생물학적 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 안정 동위원소 표지(SIL)는 지질 분포, 동원 및 대사 연구뿐만 아니라 새로운 지질 합성 연구에 여러 가지 이점을 제공합니다. SIL 기법을 성공적으로 구현하려면 내인성 분자에서 간섭을 제거해야 합니다. 본 연구에서는 생물학적 샘플에서 SIL 지질을 스크리닝하기 위한 고처리량 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 모기 난소 발달 중 lipid de novo 식별의 예가 표시됩니다. 상보적 액체 크로마토그래피, 트랩 이온 이동성 분광법 및 질량 분석법을 사용하면 단일 스캔(<1시간)에서 단일 샘플에서 분리 및 지질을 할당할 수 있습니다. 설명된 접근 방식은 데이터 종속 수집 및 데이터 독립적 수집의 최근 개발을 활용하며, 이동성 트랩에서의 병렬 축적을 사용한 후 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리를 사용합니다. 지방산 사슬 수준에서 SIL을 측정하면 모기의 난소 발달 중 지질 역학의 변화를 알 수 있습니다. lipids de novo 구조는 머무름 시간, 이동성 및 단편화 패턴에 따라 확실하게 할당됩니다.

서문

지질 데이터를 분석할 때 안정 동위원소 표지(SIL)는 살아있는 유기체의 대사 경로를 평가하는 효과적인 방법입니다. 이 방법에서는 분석물 내의 원자가 ^13C또는 ^2H를 포함하는 안정 동위원소로 대체됩니다. 이 동위원소는 전구체에 추가로 통합되며, 이는 나중에 지방산 내에 내장되어 그들이 존재하는 영역을 표시합니다. 이러한 동위원소를 사용하면 지질의 분포와 대사를 식별할 수 있으며, 이는 표지되지 않은 배경¹과 대조를 이룬다. 일반적인 질량 분석 플랫폼은 내인성 분자에서 오는 신호를 구별할 수 없습니다². SIL의 성공을 위해서는 초고해상도 분석 도구를 사용해야 합니다. 고분해능 Trapped Ion Mobility Spectrometry-Parallel Accumulation-Sequential Fragmentation-Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 통해 표지된 종과 표지되지 않은 종을 분리할 수 있습니다². LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 분석의 장점은 머무름 시간(RT) 및 이동성에 따라 MS 신호....

프로토콜

1. 시료 전처리

1. 곤충 해부
   1. Aedes aegypti 모기의 난소는 생후 7일이 되었을 때 마이크로니들을 사용하여 인산염 완충 식염수에서 해부합니다.
   2. 마이크로니들을 사용하여 인산염 완충 식염수에서 8개의 난소를 채취하고 -80°C의 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 보관합니다.
   3. 생물학적 복제에서 난소를 수집합니다.
2. 지질 추출
   1. 10ppm의 농도로 수집된 8개의 난소에 10μL의 내부 표준물질(ISTD)을 추가합니다. ISTD는 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린-D7(15:15)의 7중수소가 함유된 표지된 지질 혼합물입니다. 0-18:1 (D7) PC), 리소포스파티딜콜린-D7(18:1 (D7) 라이소 PC), 1-펜타데카노일-2-옥타데세노일-글리세로-3-포스포에탄올아민-D7(15:0-18:1(D7) PE), 1-올레오일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-D7(18:1(D7) 라이소 PE), 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨-D7(15:0-18:1(D7) PI), 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린-D7( 15:0-18:1 (D7) PS), ....

토론

이 프로토콜의 사용을 평가할 때 DIA-PASEF 및 MS/MS 매개변수가 해당 트리글리세라이드에 적용되는지 확인하는 것이 중요합니다. 특히, 이동성 창과 창 너비는 트리글리세리드의 패턴을 따라야 합니다. 이는 DDA 방법을 사용하여 이전 실행으로 확인할 수 있습니다. 내부 표준물질에서 트리글리세라이드를 추적할 때 DIA 설정을 위한 창은 사전 식별된 모든 관심 분자를 포괄해야 합니다. 창은 모두 동일.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36