Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi

Özet

Burada sunulan, alıkonma sürelerini, hareketliliklerini ve parçalanmalarını kullanarak kararlı izotop etiketleme yoluyla lipid yapılarını taramak için bir yöntemdir.

Özet

Lipitler oldukça çeşitlidir ve lipit yapılarındaki ve bileşimindeki küçük değişikliklerin kritik biyolojik işlevler üzerinde derin etkileri olabilir. Kararlı izotop etiketleme (SIL), lipid dağılımı, mobilizasyonu ve metabolizmasının yanı sıra de novo lipid sentezi çalışmaları için çeşitli avantajlar sunar. SIL tekniğinin başarılı bir şekilde uygulanması, endojen moleküllerden kaynaklanan girişimlerin giderilmesini gerektirir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden SIL lipidlerinin taranması için yüksek verimli bir analitik protokol tanımlanmıştır; Sivrisinek yumurtalık gelişimi sırasında lipid de novo tanımlama örnekleri gösterilecektir. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi tuzaklı iyon hareketlilik spektrometrisi ve kütle spektrometresinin kullanılması, tek bir numuneden tek bir taramada (<1 saat) ayırma ve lipit atamasına izin verir. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikimi ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışmayı kullanarak, veriye bağımlı edinim ve veriden bağımsız edinimdeki son gelişmelerden yararlanır. Yağ asidi zinciri düzeyinde SIL ölçümü, sivrisineklerin yumurtalık gelişimi sırasında lipit dinamiklerindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. Lipitler de novo yapıları, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

Giriş

Lipid verilerini analiz ederken, kararlı izotop etiketleme (SIL), canlı organizmalardaki metabolik yolları değerlendirmek için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir analit içindeki atomlar, ¹³C veya ²H içeren kararlı izotoplarla değiştirilir. Bu izotoplar ayrıca, daha sonra yağ asitlerinin içine gömülen ve bulundukları alanları etiketleyen öncülere dahil edilir. Bu izotoplarla, etiketlenmemiş arka plan¹ ile kontrast oluşturacakları için lipitlerin dağılımını ve metabolizmasını tanımlayabilirsiniz. Ortak kütle spektrometresi platformları, endojen moleküllerden gelen sinyali ayırt edemez². SIL'in baş....

Protokol

1. Numune hazırlama

1. Böcek diseksiyonu
   1. Aedes aegypti sivrisinek yumurtalıklarını 7 günlükken mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisinde inceleyin.
   2. Mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu salin solüsyonundan sekiz yumurtalık toplayın ve -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
   3. Biyolojik kopyalarda yumurtalıkları toplayın.
2. Lipid ekstraksiyonu
   1. Toplanan sekiz yumurtalığa 1 ppm'lik bir konsantrasyonda 10 μL iç standart (ISTD) ekleyin. ISTD, yedi döteryumlu 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin-D7 (15:15) içeren etiketli bir lipit karışımıd....

Tartışmalar

Bu protokolün kullanımını değerlendirirken, DIA-PASEF ve MS/MS parametrelerinin söz konusu trigliseritlere uygulanabilir olduğundan emin olmak önemlidir. Spesifik olarak, hareketlilik pencereleri ve pencere genişliği trigliseritlerin modelini takip etmelidir. Bu, DDA yöntemi kullanılarak önceki bir çalıştırma ile belirlenebilir. Dahili standartta trigliseritleri izlerken, DIA kurulumu için pencereler önceden tanımlanmış tüm ilgili molekülleri kapsamalıdır. Pencerelerin tümü eşit boyutlarda ol.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36