Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi

Özet

Burada sunulan, alıkonma sürelerini, hareketliliklerini ve parçalanmalarını kullanarak kararlı izotop etiketleme yoluyla lipid yapılarını taramak için bir yöntemdir.

Özet

Lipitler oldukça çeşitlidir ve lipit yapılarındaki ve bileşimindeki küçük değişikliklerin kritik biyolojik işlevler üzerinde derin etkileri olabilir. Kararlı izotop etiketleme (SIL), lipid dağılımı, mobilizasyonu ve metabolizmasının yanı sıra de novo lipid sentezi çalışmaları için çeşitli avantajlar sunar. SIL tekniğinin başarılı bir şekilde uygulanması, endojen moleküllerden kaynaklanan girişimlerin giderilmesini gerektirir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden SIL lipidlerinin taranması için yüksek verimli bir analitik protokol tanımlanmıştır; Sivrisinek yumurtalık gelişimi sırasında lipid de novo tanımlama örnekleri gösterilecektir. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi tuzaklı iyon hareketlilik spektrometrisi ve kütle spektrometresinin kullanılması, tek bir numuneden tek bir taramada (<1 saat) ayırma ve lipit atamasına izin verir. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikimi ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışmayı kullanarak, veriye bağımlı edinim ve veriden bağımsız edinimdeki son gelişmelerden yararlanır. Yağ asidi zinciri düzeyinde SIL ölçümü, sivrisineklerin yumurtalık gelişimi sırasında lipit dinamiklerindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. Lipitler de novo yapıları, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

Giriş

Lipid verilerini analiz ederken, kararlı izotop etiketleme (SIL), canlı organizmalardaki metabolik yolları değerlendirmek için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir analit içindeki atomlar, ¹³C veya ²H içeren kararlı izotoplarla değiştirilir. Bu izotoplar ayrıca, daha sonra yağ asitlerinin içine gömülen ve bulundukları alanları etiketleyen öncülere dahil edilir. Bu izotoplarla, etiketlenmemiş arka plan¹ ile kontrast oluşturacakları için lipitlerin dağılımını ve metabolizmasını tanımlayabilirsiniz. Ortak kütle spektrometresi platformları, endojen moleküllerden gelen sinyali ayırt edemez². SIL'in başarısı, ultra yüksek çözünürlüklü analitik araçların kullanılmasını gerektirir. Yüksek çözünürlüklü tuzaklanmış iyon hareketlilik spektrometrisi-paralel birikim sıralı parçalanma-uçuş zamanı tandem kütle spektrometrisi (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi, etiketli ve etiketsiz türlerin ayrılmasına izin verir². LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analizinin avantajı, MS sinyalinin alıkonma süresi (RT) ve hareketlilik ile filtrelenebilmesi, böylece endojen moleküllerin potansiyel girişimlerinin azaltılmasının yanı sıra istenen tüm türlerin nicelleştirilmesi ve ayrılmasıdır². TIMS'de, bir iyon önce bir gaz-mobil faza karşı sabit tutulur ve daha sonra hareketliliğine göre serbest bırakılır. Bu, önceki IMS enstrümantasyonundan daha düşük bir voltajda çalışırken yüksek çözünürlüklü mobilogramlar sağlar³. Mobilogramlar, sürüklenme sürelerine ve örtüşme miktarına göre bileşikleri ayırt etmek için kullanılabilen, sürüklenme süresine karşı yüklenecek kütle grafikleridir⁴.

Ek bir PASEF tekniği kullanılarak, hassasiyetten ödün vermeden dizileme hızı büyük ölçüde artırılır⁵. PASEF teorisi, iyonların birikimini ve ardından hareketlilik sırasına göre sıralı salınımlarını içerir. Bu, iyonların hareketliliklerine paralel hizada birikmesiyle yapılır. Bu şekilde birikme iyon kaybını önler. Ayrıca, öncü iyon seçimi, iyonların birikmesi ve salınması ile eş zamanlı olarak gerçekleşir. Bu yöntemle PASEF, PASEF kullanmayan bir TIMS cihazının tipik özelliği olan tarama başına tek tek öncüler yerine, her TIMS taraması sırasında seri olarak birden fazla öncül seçer. Öncü iyonlar, çerçeve başına yaklaşık 2 ms'lik bir TIMS taraması içinde 100 ms'lik zirvelerde eşzamanlı olarak biriktirildiğinde ve serbest bırakıldığında, sinyal bir büyüklük sırasının üzerinde yükseltilir, bu nedenle sinyal-gürültü oranı³ artar. TIMS'e PASEF ilavesi, MS/MS'nin verimliliğini artırır. TIMS-PASEF, MS/MS ile birleştirildiği için daha verimli bir parçalanma mümkündür. Konvansiyonel MS/MS tespitinden farklı olarak, öncü sinyal TIMS-PASEF'ten sıkıştırılır ve parça iyonları, öncü^3'ün TIMS elüsyon süresi ve iyon hareketliliği konumu ile aynı anda tespit edilir.

Bir kütle spektrometresinden veri alırken, istenen tarama modunda seçenekler vardır. Veriye bağlı edinim (DDA), MS1 taramasından öncü iyonları parçalamadan ve MS2 taramasını gerçekleştirmeden önce bolluklarına göre seçer. Bu tarama modu, mümkün olduğu kadar çok öncüyü parçalar. DDA yaklaşımı hedeflenmiştir ve sonuçlar iyon seçimine^{bağlı olacaktır 3}. Bununla birlikte, DDA-PASEF genellikle replikasyonlar arasındaki tekrarlanabilirlik konusunda problemler yaşar. DDA, odaklanmış bir analizde harika bir araç olsa da, karmaşık karışımlar veri toplamada daha fazla zorluk çeker⁶. Bunun nedeni, aynı anda yalnızca küçük bir miktarda iyonun izlenebilmesidir³. Veriden bağımsız edinim (DIA), önceden seçilmiş m/z pencerelerinin yoğunluklarından bağımsız olarak parçalandığı ve tümünün⁷ aralığında tarandığı bir yöntemdir. Bu tarama modu ile, tüm iyon bulutları IMS'den kütle spektrometresi^3'e iletilir. Proteomik çalışmalarda bu, DDA'ya kıyasla daha kısa bir zaman diliminde daha fazla miktarda proteinin ölçülmesine neden olur. Ek olarak, DIA, DDA'ya kıyasla daha az m/z değerini kaçırır. Bu nedenle, bu alternatif, sinyal-gürültü oranında veri tekrarlanabilirliğinde büyük gelişmeler ve DDA'dan daha iyi niceleme göstermiştir. Bu çalışmada amacımız, Tose ve ^ark.2 tarafından bildirilen yönteme DİA uygulamaktır. DDA ve DIA ediniminden yararlanarak biyolojik örneklerde SIL lipidlerinin mobilizasyonu, dağılımı ve metabolizması hakkında daha fazla ve daha kesin bilgi sağlayarak sinyallerin tekrarlanabilirliğini ve yoğunluğunu iyileştirdik.

Protokol

1. Numune hazırlama

1. Böcek diseksiyonu
   1. Aedes aegypti sivrisinek yumurtalıklarını 7 günlükken mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisinde inceleyin.
   2. Mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu salin solüsyonundan sekiz yumurtalık toplayın ve -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
   3. Biyolojik kopyalarda yumurtalıkları toplayın.
2. Lipid ekstraksiyonu
   1. Toplanan sekiz yumurtalığa 1 ppm'lik bir konsantrasyonda 10 μL iç standart (ISTD) ekleyin. ISTD, yedi döteryumlu 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin-D7 (15:15) içeren etiketli bir lipit karışımıdır. 0-18:1 (D7) PC), lizofosfatidilkolin-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil-glisero-3-fosfoetanolamin-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadekanoyl-3-oktadekenoil-sn-gliserol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil)-sn-gliserol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-oktadekenoil-sn-gliserol-D7 (18:1 MAG (D7)), kolesteril oleat-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).
   2. Oda sıcaklığında kuruyana kadar bekleyin. 100 μL bütanol/metanol ve 3 μL bütillenmiş hidroksitoluen ekleyin. 1,5 mL polipropilen tokmak ile 10 saniye boyunca manuel olarak homojenize edin.
   3. Havaneli 200 μL bütanol/metanol ile durulayın ve homojenize çözelti ile birleştirin.
   4. Mikrosantrifüj tüpünü oda sıcaklığında ve orta güçte 30 dakika boyunca sonikasyon.
   5. Tüpleri 20 °C'de 10 dakika boyunca 1600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 300 μL silanize cam ekler ile otomatik numune alma cihazına aktarın.

2. Enstrüman kurulumu

1. Mobil fazın hazırlanması
   1. İlgili oran olarak asetonitril, su ve izopropanol kullanarak 30:40:30 (mobil faz A) ve 10:5:85 (mobil faz B) bileşimine sahip mobil fazı hazırlayın. Her iki mobil fazda da, bir tampon koşulu oluşturmak için suya 10 mmol/L amonyum format ve %0.1 formik asit ekleyin.
   2. 10 mL suda 3.15 g amonyum formatı tartın. Bu çözeltinin 500 μL'sini 12.5 mL suya ekleyin. Sırayla, 250 mL'lik hacimsel bir şişeye koyun ve şişenin yaklaşık 2 / 3'üne kadar izopropanol ile doldurun. Döndürerek karıştırın.
   3. 250 μL formik asit (% 85) ekleyin, 250 mL'lik doldurma hattına 25 mL asetonitril ve izopropanol ile doldurun ve karıştırın.
2. MS sisteminde, MS ayarlarında ekranın sol tarafında, minimum tarama ayarı olarak 50'yi ve maksimum tarama ayarı olarak 1850'yi seçerek kütle aralığını belirleyin.
   1. Pozitif iyon modu olarak Polarite'yi seçin. Tarama modunu DIA-PASEF olarak seçin. Bunu yapmak için, aşağıdaki LC parametreleriyle önceki bir DDA yönteminden Analiz yöntemini ayarlayın ve açın'ı seçin.
      1. Degrade ayrımı için:
         Numune enjeksiyonu:% 0 B, tutma süresi 1 dak.
         %55 B'ye yükseltin, 6.4 dakikaya kadar basılı tutun.
         %65 B'ye yükseltin, 24 dakikaya kadar basılı tutun.
         %88 B'ye yükseltin, 40,8 dakikaya kadar basılı tutun.
         %95 B'ye yükseltin, 48,1 dakikaya kadar basılı tutun.
         % 35 B'ye düşürün, 56 dakikaya kadar basılı tutun.
         % 0 B'ye düşürün, 60 dakikaya kadar basılı tutun.
      2. HPLC koşulları için:
         Enjeksiyon hacmi: 5 μL
         Çözücü oranı: 0,25 mL/dak
         Toplam çalışma süresi: 60 dakika, bunun 5 dakikası sütunu ön koşullandırmak içindir.
      3. Kolonu sıvı kromatografına yerleştirerek sıvı kromatografını hazırlayın. Sütunu temizlemek ve sızıntı olup olmadığını test etmek için bir boşluk çalıştırın. Bu, cihazın basınç veya akış tutmamasında görülebilir.
3. Yeni bir yöntem oluşturmak için aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin (Şekil 1 ve Şekil 2).
   1. Yazılımı açın ve Tüm enstrümanları bağla'ya tıklayın. Bağlantı başarılı olursa, LC sistemi bir kez bip sesi çıkarır ve kontrol ekranı, herhangi bir hata mesajı olmadan Durum kutusunda HyStar'ı listeler.
   2. Edinme sekmesine tıklayın. Örnek Tablo Gezgini'nde, etiket açılır menüsünü bulun ve önceki bir yöntemi seçin.
   3. En son örnek tabloyu ikiye katlayın. Farklı Kaydet... 'e tıklayın ve yeni örnek listeyi şu biçimde kaydedin: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) burada (XXXX) analizin kısa bir tanımlayıcısıdır.
   4. Ayırma yöntemine sağ tıklayın ve Yöntemi Düzenle'ye tıklayın. Modül Yöntemini Düzenle'ye tıklayın.
   5. İndir'e tıklayın. Başarılı olursa, İndirme başarılı oldu açılır pencere. Kaydetme yöntemi olmadan ekranı kapatın.
   6. MS ayarları altında TIMS ayarlarına gidin, 1/k0 başlangıcını 0,70'te ve 1/k0 bitişini 1,85'te seçin. Rampa süresini 150 ms olarak ayarlayın. Bununla, görev döngüsü ve rampa hızı otomatik olarak ayarlanır.
   7. Alt pencerede, Kaynak sekmesini seçin. Kaynak tipini ESI olarak seçin ve uç plaka ofsetini 800 V'a ve kılcal damarı 4500 V'a ayarlayın. Nebulizatör kutusunu kontrol edin ve basıncı 4,0 bar'a ayarlayın. Kuru gazı 4,0 L/dk'ya ve kuru sıcaklığı 250 °C'ye ayarlayın.
   8. Kaynak sekmesinin sağında, Ayar sekmesini seçin. Genel Alt sekmesine tıklayın ve aktarım başlığı altında aşağıdaki parametrelerin sağlandığından emin olun:
      Sapma 1 delta: 70 V
      Huni 1 RF: 250 vpp
      isCID enerjisi: 0 eV
      Huni 2 RF: 250 vpp
      Çok kutuplu RF: 500 vpp.
      1. Çarpışma hücresi başlığı altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
         Çarpışma enerjisi: 6.0 eV
         Çarpışma RF: 1200 vpp.
      2. Dört kutuplu başlık altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
         İyon enerjisi: 6 eV
         Düşük kütle: 250 m/z.
      3. Odak öncesi TOF sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
         Aktarım süresi: 45 μs
         Darbe öncesi depolama: 5.0 μs.
   9. İşleme Alt sekmesine tıklayın. Kütle spektrumları tepe tespiti altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
      Mutlak eşik: 667
      Mutlak eşik (100 ms AccuTime başına): 445.
      1. Hareketlilik tepe algılaması altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
         Mutlak eşik: 30.00.
   10. TIMS alt sekmesine tıklayın. Uzaklıklar sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
       Δt1: -20 V
       Δt2: -150 V
       Δt3: 70 V
       Δt4: 150 V
       Δt5: 0 V
       Δt6: 150 V
       Çarpışma hücresi: 300 V.
   11. Ayar sekmesinin sağında, MS/MS sekmesine tıklayın. Öncü iyonlar sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
       PASEF rampa sayısı: 8
       Minimum şarj: 1
       Maksimum şarj:1.
       1. Planlama sekmesi altında, Gelişmiş'i tıklatın ve aşağıdaki parametrelerin sağlandığından emin olun:
          Yoğunluklar: 0,1500, 5000, 10000
          Tekrar: 1, 10, 5, 1
          Yoğunluk Eşiği: 1500.
       2. Etkin dışlama sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
          Etkin dışlama onay işareti
          Sonra bırakın: 0.4 dk.
       3. Çarpışma altında enerji ayarları aşağıdaki parametrelerden emin olun:
          K0 (V-s/^cm3): 0.70, 1.60
          Çarpışma enerjisi (eV): 20.00, 35.00.
       4. İzolasyon genişliği ayarları altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
          Kütle (m/z): 622, 1222
          Genişlik (m/z): 1.00 2.50.
   12. DIA -PASEF kurulumu: Soldaki MS ayarları tarama modundan DIA-PASEF'i seçin. MS/MS sekmesi altında Pencere Düzenleyicisi'ni seçin. Burada, aşağıdaki parametrelerin olduğundan emin olun (Şekil 3):
       Pencere ayarları: Kütle genişliği: 50 Da; Kütle örtüşmesi: 0.0 Da; Çokgenden hesaplayın: kütle adımları; Hareketlilik pencerelerinin sayısı: 1.

3. Kalibrasyon

1. Cihaz kalibrasyonu (Şekil 4)
   1. Kalibrasyon alt sekmesi altında m/z'ye tıklayın, açılır kutudan Tuning Mix'i seçin ve sağ alt köşedeki Kalibre Et'e tıklayın.
   2. %100 puan elde edilene kadar Ayarla'ya tıklamaya devam edin.
   3. Şimdi Mobilite sekmesini seçin ve %100 kalibrasyon puanına ulaşılana kadar yukarıdaki adımların aynısını izleyin.
2. Kalibrasyon eğrisi
   1. 10 μL döteryumlu iç standart karışım ile lipit iç standart karışımını birleştirin.
      0.1-500 ng / mL standart karışımdan 10 μL döteryumlu iç standart karışım ile yedi kalibrasyon noktası kullanın.
   2. ^{2'de daha} önce açıklanan PASEF MS/MS modellerine dayalı olarak yağ asidi zincirlerine manuel olarak açıklama ekleyin.
3. SIL etiketleme verimliliği
   1. SIL içeren izotopların alanının, SIL içermeyen izotopların alanına oranını hesaplayın.
   2. Herhangi bir yerde etiketli bir atom bulma olasılığını belirleyerek teorik patteni hesaplayın.
   3. Deneysel izotop profillerini veri analizi yazılımında simüle edilen teorik modelle uyumlu hale getirerek SIL zenginleştirmesini hesaplayın.
4. Çalıştırmayı başlatma
   1. Termometre düğmesine tıklayarak sütun fırınını etkinleştirin. Vana düğmesine tıklayarak pompaları etkinleştirin.
   2. MS yöntemini daha önce kaydedilen yönteme ayarlayın. Enjeksiyon hacminin 5 μL olduğunu ve satır 1'in flakon 20:1'i hedefleyeceğini doğrulayın.
   3. Flakon 20:1'in %50 IPA/ACN'ye sahip olduğundan emin olun. Örnek listeyi kaydedin.
   4. Sırayı başlatın ve başarılı bir enjeksiyonun yapıldığını doğrulayın (sistemde enjekte edildiğini belirten bir mesajla onaylanır).
   5. Yeni bir satır oluşturmak için 1. satırı kopyalayın ve aşağıya yapıştırın. Mevcut deneye bağlı olarak satır 2'yi örneklerle doldurun. Otomatik örnekleyicide doğru konumun kullanıldığından emin olun.
   6. Mobil faz taze ise, önce üreticiden lipit karışım standartlarını enjekte ederek tepe şekli testini gerçekleştirin. Önceki sonuçlarla karşılaştırın. ² Standartlar, 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (15:0-18:1 PC), lizofosfatidilkolin (18:1 Lyso PC), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil-glisero-3-fosfoetanolamin (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (18:1 Lyso PE), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadekanoyl-3-oktadekenoil-sn-gliserol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil)-sn-gliserol (15:0-18:1 DAG), 2-oktadekenoil-sn-gliserol (18:1 MAG), kolesteril oleat (18:1 Chol Ester).
   7. Yeni satırların doğru ayırma yöntemine sahip olduğundan ve satır 1'de kullanılan ön koşullandırma yöntemine sahip olmadığından emin olun. MS yönteminin doğru olduğundan emin olun (mevcut günün yöntemi).
   8. Doğru işleme yönteminin yüklendiğini ve Otomatik İşlemi Çalıştır'ın etkinleştirildiğini kontrol edin.
   9. Geçerli çalışma bittikten sonra örneklerin analiz edildiğinden emin olmak için örnek listesini kaydedin.

4. Veri analizi

1. Açık Veri Analizi yazılımı (Şekil 5). Sol üst köşede Dosya düğmesine tıklayın ve Aç'ı seçin...
2. Tercih ettiğiniz dosyaları seçin. Dosya adına sağ tıklayın ve Özellikler'i seçin.
   1. Kalibrasyon durumunu seçin (Şekil 6). Açılır kutuda, kütle spektrometresi için İlk Kalibrasyon'u seçin. Tüm hataların 1 ppm'den az olduğundan emin olun.
   2. Ardından, İlk Hareketlilik Kalibrasyonu'nu seçin ve hatanın 1 ppm'den az olduğunu onaylayın.
   3. Kromatogram'a sağ tıklayın ve Kromatogramı Düzenle'yi seçin (Şekil 6C). Type (Tür) bölümünde, açılır kutuya tıklayın ve Ekstrakte Edilmiş İyon Kromatogramı'nı seçin (Şekil 6D). Filtre altında, Tüm MS'yi seçin ve tarama modu ile Tümü'nü seçin. Bu, ilgilenilen molekülün yalnızca parçalarından ziyade zirvelerini görmek içindir.
      1. Bunun altında, molekül seçimi için iki filtre seçeneği vardır: Kütleler veya Formül. Kütleler seçilirse, ilgilenilen moleküllerin teorik m/z'si seçilebilir. Bu durumda 829.7985 m/z'yi seçin. Formül seçilirse, molekül için formülün yanı sıra kromatogram için ilgilenilen iyon formları da seçilebilir. Bu durumda, amonyum [M+NH₄] seçin. Bunun nedeni, bu iyon formunda iyonlaşmayı destekleyecek olan mobil fazdaki amonyum tamponudur (Şekil 7).
      2. Genişlik için ±1'i seçin. Polarite için pozitif modu koruduğundan emin olun. Hareketlilik altında 1.455-1.465'i seçin. Bu, bu değerlere girmeyen molekülleri filtrelemek ve ilgilenilen molekülü izole etmek için yapılır.
3. Parametreler seçildikten sonra, sağ üstteki Ekle > Tamam'ı tıklayın. Kısa bir süre sonra, yazılım seçimleri işleyecek ve bir kromatogram çıkaracaktır.
4. İlgilenilen zirvenin başındaki taban çizgisine sağ tıklayın ve zirvenin sonuna kadar basılı tutarak sürükleyin. Bu manuel entegrasyon, bu tutma süresi içinde canlı bir parça kütle spektrumu sağlayacaktır.
5. Mobilogram
   1. Mobilogram'da ekranın sol tarafına sağ tıklayın ve Mobilogramı Düzenle'yi seçin (Şekil 8). Edit Mobilogram Traces (Mobilogram İzlerini Düzenle) adlı bir pencere açılacaktır. C.e.i.1'den C.e.i.5'e kadar olan aynı adımları izleyin (Şekil 9).
   2. Saklama Süresinde, ilgilenilen zirvenin tutma süresini girin. Bu durumda, 37.45-37.55 dk.
   3. Parametreler seçildikten sonra, sağ üstteki Ekle > Tamam'ı tıklayın. Kısa bir süre sonra, yazılım seçimleri işleyecek ve bir kromatogram çıkaracaktır.
6. Ekstrakte edilen iyonlar için, bir iyon listesi oluşana kadar 4.2.3.1-4.3.2.2 adımlarını tekrarlayın.
7. MS penceresinin alt kısmında, MS Profili ve Parça MS'yi seçin. Bu, tam tarama ve PASEF'ten iyonların spektrum görünümüne izin verecektir.
   1. Spektrum görünümünde, sağ tıklayın ve Bileşik Spektrumları Kopyala'yı seçin. Sağda görünen spektrum verileriyle, çözünürlük çözme gücü, yoğunluk ve sinyal-gürültü oranı (S/N; Şekil 10).
8. Işleme
   1. Verileri işlemek için, ilgilenilen molekül hakkında değerli bilgiler elde etmek için kromatogramı ve hareketlilik tepe noktalarını manuel olarak entegre edin (Şekil 10).
   2. Bul'a sağ tıklayın ve Yalnızca Entegre Et'i seçin kromatogram veya mobilogram (Şekil 11). Sol tıklayın ve istediğiniz zirveyi vurgulayın. Bu bilgiler saklama süresini, alanı, S/N'yi ve hareketliliği içerir.

Sonuçlar

Kararlı izotop etiketlemesi, dişi sivrisinek yumurtalıklarının lipid dinamiği çalışmalarında trigliseritlerin görselleştirilmesini kolaylaştırır. 2D mobilite alanında, trigliserid 48:1, mobilite 1/K₀ ile ilgili olarak belirli bir alıkonma süresine sahip bir bölgede görüntülenir. Trigliseridin yoğunluğu daha koyu mavi bir çizgi ile görselleştirilebilir. Diğer noktalar, yumurtalık içinde bulunan ek trigliseritleri temsil eder. Tutma süreleri ve hareketlilikleri, kütle ve yapılard...

Tartışmalar

Bu protokolün kullanımını değerlendirirken, DIA-PASEF ve MS/MS parametrelerinin söz konusu trigliseritlere uygulanabilir olduğundan emin olmak önemlidir. Spesifik olarak, hareketlilik pencereleri ve pencere genişliği trigliseritlerin modelini takip etmelidir. Bu, DDA yöntemi kullanılarak önceki bir çalıştırma ile belirlenebilir. Dahili standartta trigliseritleri izlerken, DIA kurulumu için pencereler önceden tanımlanmış tüm ilgili molekülleri kapsamalıdır. Pencerelerin tümü eşit boyutlarda ol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36