Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS

Resumen

Aquí se presenta un método para el cribado de estructuras lipídicas mediante el marcaje de isótopos estables mediante el uso de su tiempo de retención, movilidad y fragmentación.

Resumen

Los lípidos son muy diversos, y pequeños cambios en las estructuras y composición de los lípidos pueden tener efectos profundos en las funciones biológicas críticas. El marcaje de isótopos estables (SIL) ofrece varias ventajas para el estudio de la distribución, movilización y metabolismo de los lípidos, así como para la síntesis de lípidos de novo . La implementación exitosa de la técnica SIL requiere la eliminación de las interferencias de las moléculas endógenas. En el presente trabajo, describimos un protocolo analítico de alto rendimiento para el cribado de lípidos SIL a partir de muestras biológicas; Se mostrarán ejemplos de identificación de lípidos de novo durante el desarrollo del ovario del mosquito. El uso de cromatografía líquida complementaria, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas permite la separación y asignación de lípidos a partir de una sola muestra en un solo escaneo (<1 h). El enfoque descrito aprovecha los desarrollos recientes en la adquisición dependiente de datos y la adquisición independiente de datos, utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad seguida de fragmentación secuencial y disociación inducida por colisiones. La medición del SIL a nivel de la cadena de ácidos grasos revela cambios en la dinámica lipídica durante el desarrollo ovárico de los mosquitos. Las estructuras de novo de lípidos se asignan con confianza en función de su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación.

Introducción

Al analizar datos de lípidos, el marcaje de isótopos estables (SIL) es un método eficaz para evaluar las vías metabólicas en los organismos vivos. En este método, los átomos dentro de un analito son reemplazados por isótopos estables que contienen ¹³C o ²H. Estos isótopos se incorporan a los precursores, que luego se incrustan dentro de los ácidos grasos, marcando las áreas en las que residen. Con estos isótopos, se puede identificar la distribución y el metabolismo de los lípidos, ya que contrastarán con el fondo no marcado¹. Las plataformas comunes de espectrometría de masas no son capaces de distinguir la señal proceden....

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Disección de insectos
   1. Diseccionar los ovarios del mosquito Aedes aegypti cuando tienen 7 días de edad en una solución salina tamponada con fosfato utilizando microagujas.
   2. Recoja ocho ovarios de la solución salina tamponada con fosfato utilizando microagujas y almacene en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a -80 °C.
   3. Recolectar ovarios en réplicas biológicas.
2. Extracción de lípidos
   1. Añadir 10 μL de patrón interno (ISTD) en los ocho ovarios recolectados en una concentración de 1 ppm. El ISTD es una mezcla lipídica marcada con siete deuterios de 1-penta....

Resultados

El marcaje de isótopos estables facilita la visualización de los triglicéridos en los estudios de dinámica lipídica de los ovarios de las hembras de mosquito. En el dominio de movilidad 2D, el triglicérido 48:1 se muestra en una región con un tiempo de retención específico en relación con la movilidad 1/K₀. La intensidad de los triglicéridos se puede visualizar mediante una línea azul más oscura. Otras manchas representan triglicéridos adicionales que se encuentran dentro del ovario. Los tiempos .......

Discusión

Al evaluar el uso de este protocolo, es esencial asegurarse de que los parámetros DIA-PASEF y MS/MS son aplicables a los triglicéridos en cuestión. Específicamente, las ventanas de movilidad y el ancho de la ventana deben seguir el patrón de los triglicéridos. Esto se puede determinar con una ejecución anterior utilizando el método DDA. Al realizar un seguimiento de los triglicéridos en el patrón interno, las ventanas para la configuración de DIA deben cubrir todas las moléculas de interés previamente identi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36