基于气相色谱-质谱的硬珊瑚样品靶向代谢组学研究

摘要

在这里，我们介绍了从珊瑚全生物中提取和制备极性和半极性代谢物，以及分离的珊瑚宿主组织和共生菌科细胞组分，用于气相色谱-质谱分析。

摘要

基于气相色谱-质谱（GC-MS）的方法已被证明在阐明刺胞动物-甲藻共生的代谢基础以及珊瑚如何对压力做出反应（即在温度诱导的漂白过程中）方面非常有效。珊瑚全息的稳态代谢物分析，包括刺胞动物宿主及其相关微生物（共生菌科和其他原生生物、细菌、古细菌、真菌和病毒），已成功应用于环境和压力条件下，以表征珊瑚的整体代谢状态。

然而，要回答围绕共生相互作用的问题，有必要独立分析珊瑚宿主及其藻类共生体的代谢物谱，这只能通过对组织进行物理分离和分离，然后进行独立的提取和分析来实现。虽然代谢组学的应用在珊瑚领域相对较新，但研究小组的持续努力已经开发出分析珊瑚中代谢物的可靠方法，包括珊瑚宿主组织和藻类共生体的分离。

本文介绍了用于GC-MS分析的全生物分离和代谢物提取的分步指南，包括需要考虑的关键优化步骤。我们证明了，一旦独立分析，两个部分（珊瑚和共生菌科）的组合代谢物谱如何与整体（holobiont）的图谱相似，但通过分离组织，我们还可以获得有关两个伴侣之间的代谢和相互作用的关键信息，这些信息无法单独从整体中获得。

引言

代谢物代表细胞过程的最终产物，代谢组学 - 研究给定生物体或生态系统产生的一系列代谢物 - 可以提供生物体功能的直接测量¹.这对于探索生态系统、共生相互作用和恢复工具尤为重要，因为大多数管理战略的目标是保护（或恢复）特定的生态系统服务功能²。珊瑚礁是一种水生生态系统，它证明了代谢组学在阐明共生相互作用以及将珊瑚生理反应与群落水平和生态系统水平影响联系起来方面的潜在价值³.高通量气相色谱-质谱联用 （GC-MS） 的应用尤其受到重视，因为它能够以高选择性和灵敏度同时快速分析多种代谢物类别，在光谱库可用时提供快速化合物鉴定，并提供高水平的重现性和准确性，每个样品的成本相对较低。

珊瑚是由珊瑚动物、光合甲藻内共生体（科：共生虫科⁴）和复杂的微生物组 ^5,6 组成的全生物体。总体而言，全息生物的适应性主要通过小分子和元素的交换来维持，以支持每个成员的代谢功能7,8,9,10。

研究方案

注：实验设计、样品收集和储存已在别处详细描述2,30,31。在收集和实验之前，必须获得收集野生珊瑚的许可批准。这里的样本是从巴达维亚珊瑚养殖场（华盛顿州杰拉尔顿）进口的Montipora mollis（绿色形态）群落中采集的，最初是从阿布罗洛斯群岛（西澳大利亚州;28°52'43.3“S 114°00'17.0”E）附近的一个珊瑚礁中采集的，深度为1米，根据水产养殖许可证AQ1643。在取样之前，将菌落保持在35 PSU的800 L水族箱中，在150 μmol光子·m−²·s⁻¹的蓝光和白光下，在25 °C±0.5 °C下保存3个月。将珊瑚碎片（~5 cm^2，N = 6）在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直至处理。

1. 提取液和设备的制备

1. 至少在去除珊瑚组织前 1 天，准备提取溶液和设备。
2. 在4°C的清洁，无洗涤剂的玻璃器皿中预冷超纯水。
3. 将 100% LC 级甲醇与终浓度为 10 μg·mL⁻¹ 的适当内标（例如 ¹³C₆ 山梨糖醇）混合。

讨论

宿主和共生体的分离可以通过简单的离心轻松快速地实现，这里的结果表明，分离馏分可以提供有价值的信息，表明特定的全生物成员的贡献，这有助于珊瑚健康的功能分析。在成年珊瑚中，脂质合成主要由常驻藻类共生体 40 进行，它提供脂质（例如，三酰基甘油和磷脂）41 和可以促进应激恢复的脂肪酸 ^11,42。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread