כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים

Summary

במאמר זה אנו מציגים את ההפקה וההכנה של מטבוליטים קוטביים וקוטביים למחצה מהולובונט אלמוגים, כמו גם רקמת מארח אלמוגים מופרדת ושברי תאים Symbiodiniaceae, לצורך ניתוח ספקטרומטריית מסות של כרומטוגרפיית גז.

Abstract

גישות המבוססות על ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה של גז (GC-MS) הוכיחו את עצמן כחזקות להבהרת הבסיס המטבולי של סימביוזה cnidarian-dinoflagellate וכיצד אלמוגים מגיבים ללחץ (כלומר, במהלך הלבנה הנגרמת על ידי טמפרטורה). פרופיל מטבוליטים במצב יציב של הולוביונט האלמוגים, הכולל את הפונדקאי הקנידריאני ואת המיקרובים הקשורים אליו (Symbiodiniaceae ופרוטיסטים אחרים, חיידקים, ארכאה, פטריות ווירוסים), יושם בהצלחה בתנאי סביבה ועקה כדי לאפיין את המצב המטבולי ההוליסטי של האלמוג.

עם זאת, כדי לענות על שאלות סביב אינטראקציות סימביוטיות, יש צורך לנתח את פרופילי המטבוליטים של מארח האלמוגים וסימביונטות האצות שלו באופן עצמאי, אשר ניתן להשיג רק על ידי הפרדה פיזית ובידוד של הרקמות, ואחריו מיצוי עצמאי וניתוח. בעוד היישום של מטבולומיקה הוא חדש יחסית בתחום האלמוגים, המאמצים המתמשכים של קבוצות מחקר הביאו לפיתוח שיטות חזקות לניתוח מטבוליטים באלמוגים, כולל הפרדת הרקמה המארחת של האלמוגים וסימביונטים של אצות.

מאמר זה מציג מדריך שלב אחר שלב להפרדת הולוביונט ומיצוי מטבוליטים לניתוח GC-MS, כולל שלבי אופטימיזציה מרכזיים שיש לקחת בחשבון. אנו מדגימים כיצד, לאחר ניתוח עצמאי, פרופיל המטבוליטים המשולב של שני השברים (אלמוגים ו- Symbiodiniaceae) דומה לפרופיל של השלם (holobiont), אך על ידי הפרדת הרקמות, אנו יכולים גם לקבל מידע מפתח על חילוף החומרים והאינטראקציות בין שני השותפים שלא ניתן להשיג מהשלם בלבד.

Introduction

מטבוליטים מייצגים את התוצרים הסופיים של תהליכים תאיים, ומטבולומיקה - המחקר של חבילת המטבוליטים המיוצרים על ידי אורגניזם או מערכת אקולוגית נתונה - יכולה לספק מדד ישיר לתפקוד אורגניזם¹. זה קריטי במיוחד לחקר מערכות אקולוגיות, אינטראקציות סימביוטיות וכלי שיקום, שכן המטרה של רוב אסטרטגיות הניהול היא לשמר (או לשחזר) פונקציות ספציפיות של שירותי מערכת אקולוגית². שוניות אלמוגים הן מערכת אקולוגית מימית אחת המדגימה את הערך הפוטנציאלי של מטבולומיקה להבהרת אינטראקציות סימביוטיות ולקישור תגובות פיזיולוגיות של אלמוגים להשפעות ברמת הקהילה וברמת המערכת האקולוגית³. היישום של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז בתפו....

Protocol

הערה: תכנון הניסוי, איסוף הדגימות ואחסונם תוארו בפירוט במקומות אחרים 2,30,31. יש לקבל אישור לאיסוף אלמוגי בר לפני איסוף וניסויים. הדגימות כאן נאספו ממושבות של Montipora mollis (שינוי צורה בצבע ירוק) שיובאו מחוות האלמוגים Batavia (Geraldton, WA), שנאספו במקור משונית ליד איי אברוהלוס (מערב אוסטרליה; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) בעומק של 1 מ 'תחת רישיון חקלאות ימית AQ1643. לפני הדגימה, המושבות הוחזקו באקווריום של 800 ליטר ב 35 PSU, תחת אור כחול לבן ב 150 μmol פוטונים ·m −²·s ⁻¹, וב 25 ° C ± 0.5 ° C במשך 3 חודשים. שברי האלמוגים (~5 ס"מ², N....

תוצאות

כל הנתונים שהופקו במהלך עבודה זו זמינים במידע המשלים.

הפרדה בין מארח לסימביונט

איור 1: הגדרה ותיקוף של ההפרדה בין רקמות מארחות אלמוגים ותאי Symbiodiniaceae. (

Discussion

ההפרדה בין הפונדקאי לסימביונט ניתנת להשגה בקלות ובמהירות באמצעות צנטריפוגה פשוטה, והתוצאות כאן מראות כי הפרדת השברים יכולה לספק מידע רב ערך המעיד על תרומות ספציפיות של חברי הולוביונט, אשר יכול לתרום לניתוח פונקציונלי של בריאות האלמוגים. באלמוגים בוגרים, סינתזת שומנים מבוצעת בעיקר ע.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread