Cromatografía de gases-Espectrometría de masas basada en metabolómica dirigida de muestras de coral duro

Resumen

Aquí, presentamos la extracción y preparación de metabolitos polares y semipolares de un holobionte de coral, así como tejido huésped de coral separado y fracciones celulares de Symbiodiniaceae, para el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Resumen

Los enfoques basados en cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) han demostrado ser poderosos para dilucidar la base metabólica de la simbiosis cnidario-dinoflagelada y cómo responde el coral al estrés (es decir, durante el blanqueamiento inducido por la temperatura). El perfil de metabolitos en estado estacionario del holobionte de coral, que comprende el huésped cnidario y sus microbios asociados (Symbiodiniaceae y otros protistas, bacterias, arqueas, hongos y virus), se ha aplicado con éxito en condiciones ambientales y de estrés para caracterizar el estado metabólico holístico del coral.

Sin embargo, para responder a las preguntas que rodean las interacciones simbióticas, es necesario analizar los perfiles de metabolitos del coral huésped y sus simbiontes de algas de forma independiente, lo que solo puede lograrse mediante la separación física y el aislamiento de los tejidos, seguidos de una extracción y análisis independientes. Si bien la aplicación de la metabolómica es relativamente nueva en el campo de los corales, los esfuerzos sostenidos de los grupos de investigación han dado como resultado el desarrollo de métodos robustos para analizar los metabolitos en los corales, incluida la separación del tejido huésped de coral y los simbiontes de algas.

Este artículo presenta una guía paso a paso para la separación de holobiontes y la extracción de metabolitos para el análisis de GC-MS, incluidos los pasos clave de optimización para su consideración. Demostramos cómo, una vez analizado de forma independiente, el perfil de metabolitos combinados de las dos fracciones (coral y Symbiodiniaceae) es similar al perfil del conjunto (holobionte), pero al separar los tejidos, también podemos obtener información clave sobre el metabolismo y las interacciones entre los dos socios que no se puede obtener del todo por sí solo.

Introducción

Los metabolitos representan los productos finales de los procesos celulares, y la metabolómica -el estudio del conjunto de metabolitos producidos por un organismo o ecosistema determinado- puede proporcionar una medida directa del funcionamiento del organismo^. Esto es particularmente crítico para explorar los ecosistemas, las interacciones simbióticas y las herramientas de restauración, ya que el objetivo de la mayoría de las estrategias de manejo es preservar (o restaurar) funciones específicas de los servicios ecosistémicos². Los arrecifes de coral son un ecosistema acuático que demuestra el valor potencial de la metab....

Protocolo

NOTA: El diseño experimental, la recolección de muestras y el almacenamiento se han descrito en detalle en otro lugar 2,30,31. La aprobación del permiso para la recolección de corales silvestres debe obtenerse antes de la recolección y experimentación. Las muestras aquí fueron colectadas de colonias de Montipora mollis (color verde-morfo) importadas de Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), originalmente recolectadas de un arrecife frente a las Islas Abrohlos (Australia Occidental; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) a una profundidad de 1 m bajo la Licencia de Acuicultura AQ1....

Discusión

La separación del huésped y el simbionte se puede lograr fácil y rápidamente a través de una simple centrifugación, y los resultados aquí muestran que la separación de las fracciones puede proporcionar información valiosa indicativa de contribuciones específicas de miembros holobiontes, que pueden contribuir al análisis funcional de la salud de los corales. En los corales adultos, la síntesis de lípidos es realizada principalmente por el simbionte de algas residente 40, que suministra lípidos (por .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread