Métabolomique ciblée basée sur la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse d’échantillons de corail dur

Résumé

Nous présentons ici l’extraction et la préparation de métabolites polaires et semi-polaires à partir d’un holobionte corallien, ainsi que de tissus coralliens hôtes séparés et de fractions cellulaires de Symbiodiniaceae, pour l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse.

Résumé

Les approches basées sur la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse (GC-MS) se sont avérées puissantes pour élucider la base métabolique de la symbiose cnidaire-dinoflagellé et la façon dont le corail réagit au stress (c’est-à-dire pendant le blanchissement induit par la température). Le profilage des métabolites à l’état d’équilibre de l’holobionte corallien, qui comprend l’hôte cnidaire et ses microbes associés (Symbiodiniaceae et autres protistes, bactéries, archées, champignons et virus), a été appliqué avec succès dans des conditions ambiantes et de stress pour caractériser l’état métabolique holistique du corail.

Cependant, pour répondre aux questions entourant les interactions symbiotiques, il est nécessaire d’analyser les profils de métabolites de l’hôte corallien et de ses symbiotes algales indépendamment, ce qui ne peut être réalisé que par une séparation physique et un isolement des tissus, suivis d’une extraction et d’une analyse indépendantes. Bien que l’application de la métabolomique soit relativement nouvelle dans le domaine corallien, les efforts soutenus des groupes de recherche ont abouti au développement de méthodes robustes pour analyser les métabolites dans les coraux, y compris la séparation du tissu hôte du corail et des symbiotes d’algues.

Cet article présente un guide étape par étape pour la séparation des holobiontes et l’extraction des métabolites pour l’analyse GC-MS, y compris les étapes clés de l’optimisation à prendre en compte. Nous montrons comment, une fois analysé indépendamment, le profil métabolitique combiné des deux fractions (corail et Symbiodiniaceae) est similaire au profil de l’ensemble (holobionte), mais en séparant les tissus, nous pouvons également obtenir des informations clés sur le métabolisme et les interactions entre les deux partenaires qui ne peuvent être obtenues à partir de l’ensemble seul.

Introduction

Les métabolites représentent les produits finaux des processus cellulaires, et la métabolomique - l’étude de l’ensemble des métabolites produits par un organisme ou un écosystème donné - peut fournir une mesure directe du fonctionnement de l’organisme¹. Ceci est particulièrement important pour l’exploration des écosystèmes, des interactions symbiotiques et des outils de restauration, car l’objectif de la plupart des stratégies de gestion est de préserver (ou de restaurer) des fonctions de services écosystémiques spécifiques². Les récifs coralliens sont un écosystème aquatique qui démontre la valeur potentielle de la méta....

Protocole

NOTE : Le plan expérimental, le prélèvement et l’entreposage des échantillons ont été décrits en détail ailleurs ^2,30,31. L’autorisation de prélèvement de coraux sauvages doit être obtenue avant la collecte et l’expérimentation. Les échantillons ici ont été prélevés sur des colonies de Montipora mollis (forme de couleur verte) importées de Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), prélevées à l’origine sur un récif au large des îles Abrohlos (Australie-Occidentale ; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) à une profondeur de 1 m en vertu du permis d’aquaculture AQ1643. Avant l’échant....

Discussion

La séparation de l’hôte et du symbiote est facilement et rapidement réalisable par simple centrifugation, et les résultats montrent ici que la séparation des fractions peut fournir des informations précieuses indiquant des contributions spécifiques des membres de l’holobionte, ce qui peut contribuer à l’analyse fonctionnelle de la santé des coraux. Chez les coraux adultes, la synthèse des lipides est principalement effectuée par le symbiote algale^{résident 40}, qui fournit.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread