Metabolômica Direcionada Baseada em Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas de Amostras de Corais Duros

Resumo

Aqui, apresentamos a extração e preparação de metabólitos polares e semipolares de um holobionte de coral, bem como tecido hospedeiro coral separado e frações celulares de Symbiodiniaceae, para análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.

Resumo

Abordagens baseadas em cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS) provaram ser poderosas para elucidar a base metabólica da simbiose cnidário-dinoflagelado e como os corais respondem ao estresse (isto é, durante o branqueamento induzido pela temperatura). O perfil de metabólitos em estado estacionário do holobionte do coral, que compreende o hospedeiro cnidário e seus micróbios associados (Symbiodiniaceae e outros protistas, bactérias, arqueias, fungos e vírus), tem sido aplicado com sucesso sob condições ambientais e de estresse para caracterizar o estado metabólico holístico do coral.

No entanto, para responder às questões que envolvem as interações simbióticas, é necessário analisar os perfis de metabólitos do hospedeiro coral e seus simbiontes algais de forma independente, o que só pode ser alcançado pela separação física e isolamento dos tecidos, seguido de extração e análise independentes. Embora a aplicação da metabolômica seja relativamente nova no campo dos corais, os esforços sustentados de grupos de pesquisa resultaram no desenvolvimento de métodos robustos para analisar metabólitos em corais, incluindo a separação do tecido hospedeiro dos corais e dos simbiontes algais.

Este artigo apresenta um guia passo-a-passo para a separação de holobiontes e a extração de metabólitos para análise de CG-EM, incluindo os principais passos de otimização para consideração. Demonstramos como, uma vez analisado independentemente, o perfil combinado de metabólitos das duas frações (coral e Symbiodiniaceae) é semelhante ao perfil do todo (holobionte), mas separando os tecidos, também podemos obter informações importantes sobre o metabolismo e as interações entre os dois parceiros que não podem ser obtidas do todo isoladamente.

Introdução

Metabólitos representam os produtos finais dos processos celulares, e a metabolômica - o estudo do conjunto de metabólitos produzidos por um determinado organismo ou ecossistema - pode fornecer uma medida direta do funcionamento do organismo¹. Isso é particularmente crítico para explorar ecossistemas, interações simbióticas e ferramentas de restauração, já que o objetivo da maioria das estratégias de manejo é preservar (ou restaurar) funções específicas de serviços ecossistêmicos². Os recifes de coral são um ecossistema aquático que demonstra o valor potencial da metabolômica para elucidar interações simbióticas e ligar ....

Protocolo

NOTA: O planejamento experimental, a coleta e o armazenamento das amostras foram descritos em detalhes em outra publicação 2,30,31. A aprovação da licença para a recolha de corais selvagens deve ser obtida antes da recolha e experimentação. As amostras foram coletadas de colônias de Montipora mollis (cor verde-morfo) importadas da Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), originalmente coletadas de um recife ao largo das Ilhas Abrohlos (Austrália Ocidental; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) a uma profundidade de 1 m sob a Licença de Aquicultura AQ1643. Antes da amostragem, as c....

Discussão

A separação do hospedeiro e do simbionte é fácil e rapidamente alcançável através de centrifugação simples, e os resultados aqui mostram que a separação das frações pode fornecer informações valiosas indicativas de contribuições específicas dos membros do holobionte, o que pode contribuir para a análise funcional da saúde dos corais. Em corais adultos, a síntese lipídica é realizada primariamente pelo simbionte algal residente 40, que fornece lipídios (por exemplo, triacilgliceróis e fos.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread