Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Burada, gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi analizi için bir mercan holobiontundan polar ve yarı polar metabolitlerin yanı sıra ayrılmış mercan konakçı dokusu ve Symbiodiniaceae hücre fraksiyonlarının ekstraksiyonunu ve hazırlanmasını sunuyoruz.

Özet

Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) tabanlı yaklaşımların, cnidarian-dinoflagellat simbiyozunun metabolik temelini ve mercanın strese nasıl tepki verdiğini (yani, sıcaklığa bağlı ağartma sırasında) aydınlatmak için güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Cnidarian konakçısını ve onunla ilişkili mikropları (Symbiodiniaceae ve diğer protistler, bakteriler, arkeler, mantarlar ve virüsler) içeren mercan holobiontunun kararlı durum metabolit profili, mercanın bütünsel metabolik durumunu karakterize etmek için ortam ve stres koşulları altında başarıyla uygulanmıştır.

Bununla birlikte, simbiyotik etkileşimleri çevreleyen soruları cevaplamak için, mercan konakçısının ve alg simbiyontlarının metabolit profillerini bağımsız olarak analiz etmek gerekir, bu da yalnızca dokuların fiziksel olarak ayrılması ve izolasyonu ile elde edilebilir, ardından bağımsız ekstraksiyon ve analiz ile elde edilebilir. Metabolomiklerin uygulanması mercan alanı için nispeten yeni olsa da, araştırma gruplarının sürekli çabaları, mercan konakçı dokusunun ve alg simbiyontlarının ayrılması da dahil olmak üzere mercanlardaki metabolitleri analiz etmek için sağlam yöntemlerin geliştirilmesiyle sonuçlanmıştır.

Bu makale, dikkate alınması gereken temel optimizasyon adımları da dahil olmak üzere, GC-MS analizi için holobiont ayrımı ve metabolitlerin ekstraksiyonu için adım adım bir kılavuz sunmaktadır. Bağımsız olarak analiz edildikten sonra, iki fraksiyonun (mercan ve Symbiodiniaceae) birleşik metabolit profilinin bütünün profiline (holobiont) nasıl benzer olduğunu gösteriyoruz, ancak dokuları ayırarak, iki ortağın metabolizması ve etkileşimleri hakkında tek başına bütünden elde edilemeyen önemli bilgiler de elde edebiliriz.

Giriş

Metabolitler, hücresel süreçlerin son ürünlerini temsil eder ve metabolomikler - belirli bir organizma veya ekosistem tarafından üretilen metabolitler paketinin incelenmesi - organizma işleyişinin doğrudan bir ölçüsünü sağlayabilir1. Bu, ekosistemleri, simbiyotik etkileşimleri ve restorasyon araçlarını keşfetmek için özellikle kritiktir, çünkü çoğu yönetim stratejisinin amacı belirli ekosistem hizmet işlevlerini korumak (veya geri yüklemek)2. Mercan resifleri, simbiyotik etkileşimleri aydınlatmak ve mercan fizyolojik tepkilerini topluluk düzeyinde ve ekosistem düzeyinde etkilere bağlamak için metabolomiklerin potansiyel ....

Protokol

NOT: Deney tasarımı, numune toplama ve saklama 2,30,31 başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yabani mercanların toplanması için izin onayı, toplama ve deneyden önce alınmalıdır. Buradaki örnekler, Batavia Mercan Çiftlikleri'nden (Geraldton, WA) ithal edilen Montipora mollis (yeşil renk morfu) kolonilerinden toplanmıştır ve orijinal olarak Abrohlos Adaları açıklarındaki bir resiften toplanmıştır (Batı Avustralya; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) Su Ürünleri Yetiştiriciliği Lisansı AQ1643 kapsamında 1 m derinlikte. Örneklemeden önce, koloniler 35 PSU'da 800 L'lik ....

Temsili Sonuçlar

Bu çalışma sırasında üretilen tüm veriler ek bilgilerde mevcuttur.

Konak-simbiyont ayrımı

figure-representative results-231
Şekil 1: Mercan konakçı dokularının ve Symbiodiniaceae hücrelerinin ayrılmasının kurulumu ve doğrulanması. (A) Mercan dokusunun mercan iskeletinden ç?.......

Tartışmalar

Konakçı ve simbiyotun ayrılması, basit santrifüjleme yoluyla kolay ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve buradaki sonuçlar, fraksiyonların ayrılmasının, mercan sağlığının fonksiyonel analizine katkıda bulunabilecek spesifik holobiont üye katkılarının göstergesi olan değerli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. Yetişkin mercanlarda, lipid sentezi esas olarak lipitler (örneğin, triaçilgliserol ve fosfolipitler)41 ve stres iyileşmesini teşvik edebilen yağ asitleri

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

J.L.M., UTS Şansölyesi Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100% LC-grade methanolMerck439193LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PPEppendorf30121880Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatographShimadzuGC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beadsMerck
G1152
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosamplerShimadzuAOC6000
Bradford reagentMerckB6916Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gunOzito6270636Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
 DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thicknessAgilent122-5013
DMFMerckRTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C515N ValineMerck605514/ 600148Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plateMerckCLS3614
Glass scintillation vialsMerckV713020 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin GMerck56834if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primerv4
Rv4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight softwarev3.6
Sodium HydroxideMerckS5881Pellets to make 1 M solution
tidyversev1.3.1R package
TissueLyser LTQiagen85600Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometerShimadzuGCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plateGreinerM3812
Whirl-Pak sample bagMerckWPB01018WASample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread

Referanslar

  1. Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
  2. Matthews, J. L., Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H., et al.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.