ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づくハードコーラル試料のターゲットメタボロミクス

要約

ここでは、ガスクロマトグラフィー質量分析のために、サンゴのホロビオントからの極性および半極性代謝産物の抽出と調製、ならびに分離されたサンゴの宿主組織とSymbiodiniaceae細胞分画を紹介します。

要約

ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)ベースのアプローチは、刺胞動物と渦鞭毛藻の共生の代謝基盤と、サンゴがストレス(つまり、温度による白化)にどのように応答するかを解明するのに強力であることが証明されています。刺胞動物の宿主とそれに関連する微生物(Symbiodiniaceaeと他の原生生物、細菌、古細菌、真菌、ウイルス)で構成されるサンゴのホロビオントの定常状態代謝物プロファイリングは、サンゴの全体的な代謝状態を特徴付けるために、環境条件およびストレス条件下でうまく適用されています。

しかし、共生相互作用をめぐる疑問に答えるためには、サンゴの宿主とその藻類共生生物の代謝物プロファイルを独立して解析する必要があり、これは組織の物理的な分離と単離、それに続く独立した抽出と分析によってのみ達成できます。メタボロミクスの応用はサンゴ分野では比較的新しいものですが、研究グループの継続的な努力により、サンゴの宿主組織と藻類共生生物の分離など、サンゴの代謝物を分析するための堅牢な方法が開発されました。

このホワイトペーパーでは、GC-MS 分析のためのホロビオント分離と代謝物の抽出について、検討すべき重要な最適化ステップを含め、ステップバイステップで説明します。2つの分画(サンゴとシンビオディニア科)の複合代謝物プロファイルが全体(ホロビオント)のプロファイルと類似していることを、独立して分析すると、組織を分離することで、全体だけでは得られない2つのパートナーの代謝と相互作用に関する重要な情報も得ることができることを実証します。

概要

代謝産物は細胞プロセスの最終生成物を表し、メタボロミクス(特定の生物または生態系によって生成される一連の代謝産物の研究)は、生物の機能の直接的な尺度を提供できます¹。これは、ほとんどの管理戦略の目標は特定の生態系サービス機能を維持(または回復)することであるため、生態系、共生相互作用、および回復ツールを探求するために特に重要です²。サンゴ礁は、共生相互作用を解明し、サンゴの生理学的応答をコミュニティレベルおよび生態系^{レベルの影響に}結びつけるためのメタボロミクスの潜在的な価値を実証する水生生態系の1つです3。ハイスループットガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)のアプリケーションは、幅広い代謝物クラスを高い選択性と感度で同時に迅速に分析し、スペクトルライブラリが利用可能な場合に迅速な化合物同定を提供し、サンプルあたりのコストが比較的低く、高レベルの再現性と精度を提供する能力があるため、特に高く評価されています。

サンゴは、サンゴ動物、光合成渦鞭毛藻類の内部共生生物(科:共生虫科⁴)、および複雑なマイクロ^{バイオーム5,6}からなるホロビオントです。全体として、ホロビオント....

プロトコル

注:実験計画、サンプルの収集および保管については、^他の場所で詳細に説明されています2,30,31。野生サンゴの採集許可は、採集と実験の前に取得する必要があります。ここでのサンプルは、バタビアサンゴ農場(ワシントン州ジェラルトン)から輸入されたMontipora mollis(緑色のカラーモルフ)のコロニーから採取されたもので、もともとはアブロロス諸島(西オーストラリア州、南緯28度52分43.3秒、東経114度00分17.0秒)沖のサンゴ礁から採取され、水産養殖ライセンスAQ1643の下で水深1mで採取されました。サンプリングに先立ち、コロニーを800Lの水槽、35PSU、青色および白色光、150μmol光子・m^・2・^s-1、25°C±0.5°Cで3ヶ月間保持した。サンゴの破片(~5 cm²、N = 6)を液体窒素中で急速凍結し、処理するまで-80°Cで保存しました。

1. 抽出液と装置の準備

1. サンゴ組織を除去する少なくとも1日前に、抽出液と機器を準備します。
2. 界面活性剤を含まない清潔なガラス器具で超純水を4°Cで予冷します。
....

ディスカッション

宿主と共生生物の分離は、簡単な遠心分離によって簡単かつ迅速に達成でき、ここでの結果は、フラクションを分離することで、特定のホロビオントメンバーの寄与を示す貴重な情報が得られ、サンゴの健康の機能分析に貢献できることを示しています。成体のサンゴでは、脂質合成は主に常在する藻類共生生物⁴⁰によって行われ、脂質(例えば、トリアシルグリセロ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread