Gascromatografia-Metabolomica mirata basata sulla spettrometria di massa di campioni di corallo duro

Riepilogo

Qui, presentiamo l'estrazione e la preparazione di metaboliti polari e semi-polari da un olobionte di corallo, nonché tessuto ospite di corallo separato e frazioni cellulari di Symbiodiniaceae, per l'analisi gascromatografica-spettrometria di massa.

Abstract

Gli approcci basati sulla gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) si sono dimostrati potenti per chiarire le basi metaboliche della simbiosi cnidario-dinoflagellata e il modo in cui il corallo risponde allo stress (ad esempio, durante lo sbiancamento indotto dalla temperatura). Il profilo dei metaboliti allo stato stazionario dell'olobionte del corallo, che comprende l'ospite cnidariano e i suoi microbi associati (Symbiodiniaceae e altri protisti, batteri, archaea, funghi e virus), è stato applicato con successo in condizioni ambientali e di stress per caratterizzare lo stato metabolico olistico del corallo.

Tuttavia, per rispondere alle domande che circondano le interazioni simbiotiche, è necessario analizzare i profili dei metaboliti dell'ospite corallo e dei suoi simbionti algali in modo indipendente, il che può essere ottenuto solo mediante separazione fisica e isolamento dei tessuti, seguita da estrazione e analisi indipendenti. Mentre l'applicazione della metabolomica è relativamente nuova nel campo dei coralli, gli sforzi sostenuti dei gruppi di ricerca hanno portato allo sviluppo di metodi robusti per l'analisi dei metaboliti nei coralli, compresa la separazione del tessuto ospite del corallo e dei simbionti algali.

Questo documento presenta una guida passo-passo per la separazione degli olobionti e l'estrazione dei metaboliti per l'analisi GC-MS, comprese le principali fasi di ottimizzazione da prendere in considerazione. Dimostriamo come, una volta analizzato in modo indipendente, il profilo metabolitico combinato delle due frazioni (corallo e Symbiodiniaceae) sia simile al profilo dell'insieme (olobionte), ma separando i tessuti, possiamo anche ottenere informazioni chiave sul metabolismo e sulle interazioni tra i due partner che non possono essere ottenute dal solo tutto.

Introduzione

I metaboliti rappresentano i prodotti finali dei processi cellulari e la metabolomica - lo studio della serie di metaboliti prodotti da un determinato organismo o ecosistema - può fornire una misura diretta^{del funzionamento} dell'organismo. Ciò è particolarmente importante per l'esplorazione degli ecosistemi, delle interazioni simbiotiche e degli strumenti di ripristino, poiché l'obiettivo della maggior parte delle strategie di gestione è quello di preservare (o ripristinare)^{specifiche funzioni dei} servizi ecosistemici. Le barriere coralline sono un ecosistema acquatico che dimostra il valore potenziale della metabolomica....

Protocollo

NOTA: Il disegno sperimentale, la raccolta e la conservazione dei campioni sono stati descritti in dettaglio altrove 2,30,31. L'autorizzazione per la raccolta di coralli selvatici deve essere ottenuta prima della raccolta e della sperimentazione. I campioni qui riportati sono stati raccolti da colonie di Montipora mollis (colore verde) importate da Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), originariamente raccolte da una barriera corallina al largo delle isole Abrohlos (Australia occidentale; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) ad una profondità di 1 m nell'ambito della licenza d....

Discussione

La separazione dell'ospite e del simbionte è facilmente e rapidamente ottenibile tramite una semplice centrifugazione, e i risultati qui mostrano che la separazione delle frazioni può fornire preziose informazioni indicative di specifici contributi dei membri olobionti, che possono contribuire all'analisi funzionale della salute dei coralli. Nei coralli adulti, la sintesi lipidica è eseguita principalmente dal simbionte algale residente 40, che fornisce lipidi (ad esempio, triacilglicerolo e fosfolipidi)41 e .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread