Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben

Zusammenfassung

Hier stellen wir die Extraktion und Präparation von polaren und semipolaren Metaboliten aus einem Korallenholobionten, sowie getrenntem Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellfraktionen für die gaschromatographische Massenspektrometrie-Analyse vor.

Zusammenfassung

Auf Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) basierende Ansätze haben sich als leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Nesseltier-Dinoflagellaten-Symbiose aufzuklären und wie Korallen auf Stress reagieren (z. B. während der temperaturinduzierten Bleiche). Das Steady-State-Metaboliten-Profiling des Korallen-Holobionten, der den Nesseltierwirt und seine assoziierten Mikroben (Symbiodiniaceae und andere Protisten, Bakterien, Archaeen, Pilze und Viren) umfasst, wurde erfolgreich unter Umgebungs- und Stressbedingungen angewendet, um den ganzheitlichen Stoffwechselstatus der Koralle zu charakterisieren.

Um die Fragen rund um die symbiotischen Interaktionen zu beantworten, ist es jedoch notwendig, die Metabolitenprofile des Korallenwirts und seiner Algensymbionten unabhängig voneinander zu analysieren, was nur durch eine physikalische Trennung und Isolierung der Gewebe erreicht werden kann, gefolgt von einer unabhängigen Extraktion und Analyse. Während die Anwendung der Metabolomik im Korallenbereich relativ neu ist, haben die anhaltenden Bemühungen von Forschungsgruppen zur Entwicklung robuster Methoden zur Analyse von Metaboliten in Korallen geführt, einschließlich der Trennung des Korallenwirtsgewebes und der Algensymbionten.

In diesem Artikel wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Holobiontentrennung und die Extraktion von Metaboliten für die GC-MS-Analyse vorgestellt, einschließlich der wichtigsten Optimierungsschritte, die in Betracht gezogen werden sollten. Wir zeigen, dass das kombinierte Metabolitenprofil der beiden Fraktionen (Koralle und Symbiodiniaceae) nach unabhängiger Analyse dem Profil des Ganzen (Holobiont) ähnelt, aber durch die Trennung der Gewebe können wir auch wichtige Informationen über den Stoffwechsel und die Wechselwirkungen zwischen den beiden Partnern erhalten, die aus dem Ganzen allein nicht gewonnen werden können.

Einleitung

Metaboliten stellen die Endprodukte zellulärer Prozesse dar, und die Metabolomik - die Untersuchung der von einem bestimmten Organismus oder Ökosystem produzierten Metaboliten - kann ein direktes Maß für die Funktionsweise von Organismen liefern¹. Dies ist besonders wichtig für die Erforschung von Ökosystemen, symbiotischen Interaktionen und Wiederherstellungswerkzeugen, da das Ziel der meisten Managementstrategien darin besteht, bestimmte Ökosystemdienstleistungen zu erhalten (oder wiederherzustellen)². Korallenriffe sind ein aquatisches Ökosystem, das den potenziellen Wert der Metabolomik für die Aufklärung symbiotisch....

Protokoll

ANMERKUNG: Der Versuchsaufbau, die Probenentnahme und die Lagerung wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben 2,30,31. Die Genehmigung für das Sammeln von Wildkorallen muss vor dem Sammeln und Experimentieren eingeholt werden. Die Proben hier stammen aus Kolonien von Montipora mollis (grüne Farbmorphe), die von Batavia Coral Farms (Geraldton, WA) importiert wurden und ursprünglich von einem Riff vor den Abrohlos-Inseln (Westaustralien; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) in einer Tiefe von 1 m unter der Aquakulturlizenz AQ1643 gesammelt wurden. Vor der Probenahme wurde....

Diskussion

Die Trennung von Wirt und Symbiont ist durch einfache Zentrifugation leicht und schnell zu erreichen, und die Ergebnisse hier zeigen, dass die Trennung der Fraktionen wertvolle Informationen liefern kann, die auf spezifische Beiträge von Holobiontenmitgliedern hinweisen, die zur funktionellen Analyse der Korallengesundheit beitragen können. In erwachsenen Korallen wird die Lipidsynthese hauptsächlich vom ansässigen Algensymbionten 40 durchgeführt, der Lipide (z. B. Triacylglycerin und Phospholipide)41 und F.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread