Газовая хромато-масс-спектрометрия на основе таргетной метаболомики образцов твердых кораллов

Резюме

Здесь мы представляем экстракцию и подготовку полярных и полуполярных метаболитов из голобионта коралла, а также разделенной ткани хозяина коралла и клеточных фракций Symbiodiniaceae для анализа газовой хромато-масс-спектрометрии.

Аннотация

Подходы, основанные на газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС), оказались эффективными для выяснения метаболической основы симбиоза книдарии и динофлагеллятов и того, как кораллы реагируют на стресс (например, во время температурно-индуцированного обесцвечивания). Стационарное профилирование метаболитов кораллового голобионта, который включает в себя книдарийного хозяина и связанные с ним микробы (Symbiodiniaceae и другие протисты, бактерии, археи, грибы и вирусы), было успешно применено в условиях окружающей среды и стресса для характеристики целостного метаболического статуса коралла.

Однако, чтобы ответить на вопросы, связанные с симбиотическими взаимодействиями, необходимо проанализировать профили метаболитов коралла-хозяина и его водорослевых симбионтов независимо друг от друга, что может быть достигнуто только путем физического разделения и изоляции тканей с последующим независимым извлечением и анализом. Несмотря на то, что применение метаболомики является относительно новым для коралловой области, постоянные усилия исследовательских групп привели к разработке надежных методов анализа метаболитов в кораллах, включая разделение тканей коралла-хозяина и симбионтов водорослей.

В данной работе представлено пошаговое руководство по разделению голобионтов и экстракции метаболитов для анализа ГХ-МС, включая основные шаги оптимизации для рассмотрения. Мы демонстрируем, что при независимом анализе комбинированный профиль метаболитов двух фракций (коралловые и Symbiodiniaceae) похож на профиль целого (голобионт), но, разделяя ткани, мы также можем получить ключевую информацию о метаболизме и взаимодействиях между двумя партнерами, которая не может быть получена только из целого.

Введение

Метаболиты представляют собой конечные продукты клеточных процессов, а метаболомика – изучение набора метаболитов, продуцируемых данным организмом или экосистемой – может обеспечить прямую меру^{функционирования организма}. Это особенно важно для изучения экосистем, симбиотических взаимодействий и инструментов восстановления, поскольку целью большинства стратегий управления является сохранение (или восстановление) конкретных функций экосистемных^услуг2. Коралловые рифы представляют собой одну из водных экосистем, которая демонстрирует потенциальную ценность метаболомики для выяснения симбиотических взаимодействий и увязки фи....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: План эксперимента, сбор и хранение образцов были подробно описаны в других статьях 2,30,31. Разрешение на сбор диких кораллов должно быть получено до начала сбора и проведения экспериментов. Образцы были взяты из колоний Montipora mollis (морфа зеленого цвета), импортированных с коралловых ферм Батавии (Джералдтон, штат Вашингтон), первоначально собранных с рифа у островов Абролос (Западная Австралия; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) на глубине 1 м в соответствии с лицензией на аквакультуру AQ1643. Перед отбором проб колонии содержались в аквариуме объемом 800....

Результаты

Все данные, полученные в ходе этой работы, доступны в дополнительной информации.

Разделение симбионтов хозяина и симбионта

Рисунок 1: Настройка и валидация ?.......

Обсуждение

Разделение хозяина и симбионта легко и быстро достигается с помощью простого центрифугирования, и результаты показывают, что разделение фракций может предоставить ценную информацию, указывающую на специфический вклад голобионтов, что может способствовать функциональному анали.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread