小鼠后肢外植体研究跟腱撞击力学生物学的模型

摘要

我们提出了一个定制的实验平台和组织培养方案，该方案以持续的细胞活力再现了由小鼠后肢外植体中跟腱插入撞击驱动的纤维软骨变化，提供了一个适合探索肌腱撞击的机制生物学的模型。

摘要

肌腱撞击骨骼会产生多轴机械应变环境，横向压缩应变明显升高，从而引发局部纤维软骨表型，其特征是富含糖胺聚糖 （GAG） 的基质积累和胶原网络的重塑。虽然纤维软骨是健康肌腱撞击区域的正常特征，但过多的 GAG 沉积和胶原网络紊乱是肌腱病的标志性特征。因此，撞击在临床上被认为是肌腱病发生和发展的重要外在因素。然而，肌腱撞击背后的机制生物学研究仍未得到充分研究。先前阐明细胞对肌腱撞击反应的努力已经对细胞施加了单轴压缩，并在 体外切除了肌腱外植体。然而，分离的细胞缺乏对机械反应至关重要的三维细胞外环境，并且 体外 和切除的外植体研究都无法概括 体内肌腱撞击产生的多轴应变环境，这取决于撞击区域的解剖学特征。此外， 肌 腱撞击的体内模型缺乏对机械应变环境的控制。为了克服这些局限性，我们提出了一种适用于研究跟腱撞击机制生物学的新型小鼠后肢外植体模型。该模型将跟腱保持在 原位 以保持局部解剖结构，并再现了在被动应用踝关节背屈期间跟腱插入跟骨上产生的多轴应变环境，同时将细胞保留在其原生环境中。我们描述了该模型不可或缺的组织培养方案，并提供了在 7 天内建立持续外植体活力的数据。代表性结果表明，组织学 GAG 染色增强，继发于撞击的胶原纤维排列减少，表明纤维软骨形成增加。该模型可以很容易地适应研究不同的机械负荷方案，并允许操纵感兴趣的分子途径，以确定介导跟腱表型变化响应撞击的机制。

引言

许多肌腱，包括跟腱和肩袖肌腱，由于正常的解剖定位而经历骨撞击^1,2,3,4.肌腱撞击产生横向指向纵向纤维轴的压缩应变^5,6,7.肌腱撞击区域表现出独特的纤维软骨表型，其中收缩的圆形细胞（纤维软骨细胞）嵌入无组织的胶原网络中，糖胺聚糖 （GAG） 含量显着增加^{2,3,4,8,9,10,11,12,13}

研究方案

所有动物工作均由罗切斯特大学动物资源委员会批准。

1.组织培养基的制备

1. 在37°C和5%CO₂的培养箱中，在Dulbecco改良的Eagle培养基（1x DMEM）中培养所有外植体，其中含有1%v / v青霉素 - 链霉素和200μM L-抗坏血酸。对于最初的 48 小时预处理，在补充有 100 nM 地塞米松⁷⁴ 的 70 mL 培养基中培养每个外植体。预处理后，在没有地塞米松的情况下再培养肢体7天，每48-72小时更换一次培养基。
   注：不建议将血清（如胎牛血清）添加到培养基中，这与 Wunderli、Blache 和 Snedeker 提供的建议一致⁵⁷。简而言之，无血清条件更能代表 体内存在的无血管、营养不良的肌腱微环境。此外，在某些培养条件下，血清补充剂可以促进组织降解⁷⁵ ，并刺激细胞增殖和从组织中迁移，这两者都是肌腱病理学的特征⁵⁷。
2. 对于未上样的组，在 70 mL 培养基中培养每个外植体。对于基线张力组和静态撞击组，每个平台需要大约 125 mL 的培养基来保持肢体浸没。该体积可能因大腿在握把中的位置和 3D 打印参数（主要是填充密度）而异。
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讨论

实验性小鼠后肢外植体平台与本研究中描述的组织培养方案相结合，为研究跟腱插入处撞击驱动的纤维软骨形成的机制生物学提供了合适的模型。代表性结果证明了该外植体模型的实用性，该结果表明，在静态撞击 7 天后，甲苯胺蓝染色的显着和空间异质性变化同时维持了细胞活力。这些发现表明继发于机械撞击的富含GAG的基质分子的代谢改变，与其他模型和^{临床研究一致}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	-	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining