Modèle d’explant murin d’un membre postérieur pour l’étude de la mécanobiologie du conflit du tendon d’Achille

Résumé

Nous présentons une plate-forme expérimentale personnalisée et un protocole de culture tissulaire qui recrée le changement fibrocartilagineux induit par le conflit de l’insertion du tendon d’Achille dans les explants murins des membres postérieurs avec une viabilité cellulaire soutenue, fournissant un modèle adapté à l’exploration de la mécanobiologie du conflit tendonineux.

Résumé

L’impact tendineux sur l’os génère un environnement de déformation mécanique multiaxiale avec une déformation de compression transversale nettement élevée, ce qui provoque un phénotype de fibrocartilage localisé caractérisé par l’accumulation d’une matrice riche en glycosaminoglycanes (GAG) et le remodelage du réseau de collagène. Alors que le fibrocartilage est une caractéristique normale dans les régions touchées des tendons sains, le dépôt excessif de GAG et la désorganisation du réseau de collagène sont des caractéristiques caractéristiques de la tendinopathie. En conséquence, le conflit est cliniquement reconnu comme un facteur extrinsèque important dans l’initiation et la progression de la tendinopathie. Néanmoins, la mécanobiologie sous-jacente au conflit tendineux reste peu étudiée. Des efforts antérieurs pour élucider la réponse cellulaire au conflit tendineux ont appliqué une compression uniaxiale aux cellules et excisé des explants tendineux in vitro. Cependant, les cellules isolées n’ont pas d’environnement extracellulaire tridimensionnel crucial pour la mécanoréponse, et les études in vitro et les études d’explants excisés ne parviennent pas à récapituler l’environnement de déformation multiaxiale généré par le conflit tendineux in vivo, qui dépend des caractéristiques anatomiques de la région touchée. De plus, les modèles in vivo de conflit tendineux manquent de contrôle sur l’environnement de déformation mécanique. Pour pallier ces limitations, nous présentons un nouveau modèle d’explant de membre postérieur murin adapté à l’étude de la mécanobiologie du conflit du tendon d’Achille. Ce modèle maintient le tendon d’Achille in situ pour préserver l’anatomie locale et reproduit l’environnement de déformation multiaxiale généré par l’impact de l’insertion du tendon d’Achille sur le calcanéum lors d’une dorsiflexion passive de la cheville tout en conservant les cellules dans leur environnement d’origine. Nous décrivons un protocole de culture tissulaire faisant partie intégrante de ce modèle et présentons des données établissant la viabilité durable de l’explant sur 7 jours. Les résultats représentatifs démontrent une amélioration de la coloration histologique des GAG et une diminution de l’alignement des fibres de collagène secondaire au conflit, suggérant une formation élevée de fibrocartilage. Ce modèle peut facilement être adapté pour étudier différents régimes de charge mécanique et permet la manipulation de voies moléculaires d’intérêt pour identifier les mécanismes médiant le changement phénotypique dans le tendon d’Achille en réponse au conflit.

Introduction

Une multitude de tendons, y compris le tendon d’Achille et les tendons de la coiffe des rotateurs, subissent un conflit osseux dû à un positionnement anatomique normal^1,2,3,4. Le conflit tendineux génère une contrainte de compression dirigée transversalement à l’axe longitudinal de la fibre^5,6,7. Les régions de conflit tendineux présentent un phénotype de fibrocartilage unique dans lequel des cellules rondes rétrécies (fibrochondrocytes) sont intégr....

Protocole

Tous les travaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester.

1. Préparation des milieux de culture tissulaire

1. Cultivez tous les explants dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (1x DMEM) avec 1 % v/v de pénicilline-streptomycine et 200 μM d’acide L-ascorbique dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂. Pour le prétraitement initial de 48 h, cultiver chaque explant dans 70 mL de milieu de culture complété par 100 nM de dexaméthasone⁷⁴. Après le prétraitement, cultivez les membres pendant 7 jours supplémentaires sans dexaméth....

Discussion

La plate-forme expérimentale d’explants de membres postérieurs murins associée au protocole de culture tissulaire décrit dans cette étude fournit un modèle approprié pour étudier la mécanobiologie de la formation de fibrocartilage induite par le conflit à l’insertion du tendon d’Achille. L’utilité de ce modèle d’explant est démontrée par les résultats représentatifs, qui indiquent un maintien de la viabilité cellulaire concomitant à un changement significatif et spatialement hétérogène de l.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	-	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining