通过酶解离小鼠六块后肢肌肉获得的完整短、中和长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌

摘要

我们描述了一种从成年小鼠的六块肌肉中获得不同长度和类型的酶解离纤维的方案：其中三个已经描述（趾短屈肌，趾长伸肌，比目鱼肌），其中三个首次成功解离（拇长伸肌，腓骨长肌，腓骨趾四分）。

摘要

通过小鼠肌肉酶解离获得的骨骼肌纤维是生理实验的有用模型。然而，大多数论文都涉及趾短屈肌（FDB）的短纤维，这限制了处理纤维类型的结果范围，限制了可用的生物材料的数量，并阻碍了细胞生理现象与先前在其他肌肉中获得的生化和动力学知识之间的明确联系。

本文描述了如何从具有不同纤维类型轮廓和长度的六块肌肉中获得完整的纤维。使用 C57BL/6 成年小鼠，我们展示了肌肉解剖和纤维分离方案，并证明了纤维对 Ca²⁺ 瞬时研究及其形态学表征的适用性。还介绍了肌肉的纤维类型组成。解离时，所有肌肉都变得完整，活纤维快速收缩超过 24 小时。 FDB 提供短 （<1 mm），腓骨趾四分 （PDQA） 和腓骨长肌 （PL） 提供中间 （1-3 mm），而趾长伸肌 （EDL）、幻觉长伸肌 （EHL） 和比目鱼肌释放长 （3-6 mm） 纤维。

当用快速染料 Mag-Fluo-4 记录时，PDQA、PL 和 EHL 纤维的 Ca²⁺ 瞬变显示出快速、窄的动力学，让人联想到形态 II （MT-II），已知对应于 IIX 型和 IIB 型纤维。这与以下事实一致：与FDB（~80%）和比目鱼肌（~65%）相比，这些肌有超过90%的II型纤维。除了FDB，我们首次展示了几块肌肉的解离，这些肌肉使纤维的长度范围在1到6毫米之间。这些纤维是可行的，并产生快速的 Ca²⁺ 瞬变，表明 MT-II 可以推广到 IIX 和 IIB 快速纤维，无论它们的肌肉来源如何。这些结果增加了成熟骨骼肌研究模型的可用性。

引言

哺乳动物的成熟骨骼肌是一种多功能组织。它严重调节新陈代谢，是产生热量的主要来源，其动力学特性使其在呼吸、身体节段的运动或从一个点到另一个点的位移中起着关键作用 ^1,2,3。骨骼肌还与许多疾病的病理生理学有关，包括遗传和慢性疾病，如肌病、营养不良或肌肉减少症，以及许多非肌肉慢性疾病，如心脏代谢疾病 3,4,5,6,7,8。

在健康和疾病背景下对成熟骨骼肌的结构和功能特性的离体研究主要通过两种实验模型成为可能：全肌和分离纤维。在 20^世纪，研究人员利用不同小物种的整体完整趾长伸肌 （EDL）、比目鱼肌、胫骨前肌和腓肠肌的特性作为关键模型来了解运动单位、纤维类型和动态特性，例如收缩和松弛的力和动力学....

研究方案

根据 1989 年第 84 号法律和 1993 年第 8430 号决议，所有程序均由安蒂奥基亚大学动物实验伦理委员会 （UdeA） 批准（2016 年 6 月 21 日第 104 分钟和 2021 年 4 月 15 日 005 分钟），并按照动物研究进行和报告： 报告体内实验 （ARRIVE） 指南⁴¹.这里介绍的所有结果均来自健康的7-13周龄，20-26克，C57BL / 6雄性小鼠。图 1 显示了本研究的总体设计和程序顺序。所有试剂、材料和设备详细信息都列在材料表中。

1. 动物

1. 在受控温度（21±2°C）和光：暗（12：12小时）循环的条件下，每个亚克力，透明，矩形笼子最多容纳六只小鼠，带有木材衍生的垫料。
2. 在不富集环境的特定无病原体动物设施中为动物免费提供食物和自来水。

2. 解剖

1. 溶液、材料和试剂
   1. 制备并过滤（0.22μm）具有以下成分的工作溶液（所有浓度均为mM）：
      1. 酪状物：5.4 KCl、1 MgCl₂、140 NaC....

讨论

为了补充可用于研究成熟骨骼肌生物学的模型，我们在这里展示了一系列具有短纤维、中纤维和长纤维的小鼠肌肉的成功酶解离。这些纤维可以证明骨骼肌中 Ca²⁺ 瞬变的 MT-II 动力学的普遍性。此外，对完整、完整的肌肉中的纤维类型进行了分类。鉴于FDB是生理实验中最常用的肌肉，因此评估了解离后细胞悬液中存在的纤维类型。

用于肌肉生物学研究的短纤维、.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma Aldrich	32221
Acetone	Merck	179124
Acrylamide	Gibco BRL	15512-015
Ammonium persulfate	Panreac	141138.1610
Anti myosin I antibody	Sigma Aldrich	M4276	Primary antibody
Anti myosin II antibody	Sigma Aldrich	M8421	Primary antibody
Anti myosin IIA antibody	American Type Culture Collection	SC-71	Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	BF-F3-c	Primary antibody
Bis-acrylamide	AMRESCO	0172
Bovine serum albumin	Thermo Scientific	B14
Bradford reagent	Merck	1.10306.0500
Bromophenol blue	Carlo Erba	428658
Calcium carbonate	Merck	102066
Calcium dichloride (CaCl2)	Merck	2389
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
Collagenase type 2	Worthington	CLS-2/LS004176
Consul-Mount	Thermo Scientific	9990440
Coomassie Brilliant blue R 250	Merck	112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dithiothreitol (DTT)	AMRESCO	0281
Edetic acid (EDTA	AMRESCO	0322
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
Glycerol	Panreac	1423291211
Glycine	Panreac	151340.1067
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Hematoxylin	Thermo Scientific	6765015
HEPES	AMRESCO	0511
Hoechst 33258	Sigma Aldrich	861405
Imidazole	AMRESCO	M136
Isopentane	Sigma Aldrich	M32631
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Mag-Fluo-4, AM	Invitrogen	M14206	Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol	Applichem	A11080100
Methanol	Protokimica	MP10043
Mice	Several	Several	For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Promega	V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Tocris	1870
Optimal cutting compound (OCT)	Thermo Scientific	6769006
Secondary antibody	Thermo Scientific	A-11001	Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate	Panreac	1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8	AMRESCO	J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane	AMRESCO	M151
Triton X-100	AMRESCO	M143
Materials
Dissection chamber	Custom-made
Charged slides	Erie Scientific	5951PLUS
Experimental bath chamber	Warner Instruments	RC-27NE2	Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps	World Precision Instruments	500338, 500230
Fine scissors	World Precision Instruments	Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes	Several		Fire-polished tips
Glass vials with cap	Several		2-3 mL volumen
Operating scissors	World Precision Instruments	501223-G
Equipment
Centrifuge	Thermo Scientific	SL 8R
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cryostat	Leica	CM1850
Digital camera	Zeiss	Erc 5s and Axio 305	Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer	Molecular Devices	1550A Digidata
Electrophoresis chamber	Bio Rad	Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence	Zeiss	Axio Observer A1	Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier	Horiba	R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba	Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope	Zeiss	Stemi 508
Stimulator	Grass Instruments	S6
Water bath	Memmert	WNE-22
Xilol	Sigma Aldrich	808691
Software
Free software for electrophoreses analyses	University of Kentucky	GelBandFitter v1.7	http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry	National Institutes of Health	ImageJ v1.54	https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses	Molecular Devices	pCLAMP v10.05	https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing	OriginLab	OriginPro 2019	https://www.originlab.com/