マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて

要約

我々は、成体マウスの6つの筋肉から異なる長さとタイプの酵素的に解離した線維を得るためのプロトコルを記述する:そのうちの3つ(屈筋指筋ブレビス、長指伸筋、ヒラメ筋)と3つは初めて正常に解離した(長反母腓骨伸筋、長腓骨筋、指腓骨筋)。

要約

マウスの筋肉を酵素解離させて得られた骨格筋線維は、生理学的実験に有用なモデルです。しかし、ほとんどの論文は指屈筋(FDB)の短線維を扱っており、線維の種類を扱う結果の範囲を制限し、利用可能な生物学的物質の量を制限し、細胞の生理学的現象と他の筋肉で得られた以前の生化学的および力学的知識との明確なつながりを妨げています。

この論文では、繊維の種類と長さの異なる6つの筋肉から無傷の繊維を得る方法について説明します。C57BL/6成体マウスを用いて、筋肉解剖と線維分離のプロトコルを示し、Ca²⁺ 一過性研究とその形態特性評価に対する線維の適合性を実証しました。筋肉の繊維タイプの組成も提示されます。解離すると、すべての筋肉は無傷になり、24時間以上活発に収縮する生きた線維が形成され、FDBは短(<1mm)、指腓骨筋(PDQA)および長腓骨筋(PL)は中間(1-3mm)を与え、長指伸筋(EDL)、長母趾伸筋(EHL)、およびヒラメ筋は長い(3-6mm)線維を放出した。

高速色素Mag-Fluo-4で記録したところ、PDQA、PL、およびEHLファイバーのCa²⁺ トランジェントは、IIX型およびIIB型ファイバーに対応することが知られている形態タイプII(MT-II)を連想させる高速で狭い速度論を示しました。これは、これらの筋肉がFDB(~80%)やヒラメ筋(~65%)と比較して、II型線維の90%以上を持っているという事実と一致しています。FDBを超えて、1〜6mmの長さの範囲にわたる繊維をレンダリングするいくつかの筋肉の解離を初めて実証しました。これらの線維は生存可能であり、高速の^Ca2+ トランジェントを与え、MT-IIが筋肉源に関係なくIIXおよびIIB高速線維に一般化できることを示しています。これらの結果により、成熟した骨格筋研究のためのモデルの利用可能性が高まります。

概要

哺乳類の成熟した骨格筋は多機能組織です。それは代謝を高度に調節し、熱産生の主な源であり、その動的特性はそれに呼吸、体節の移動、またはある点^{から別の点}への変位に重要な役割を果たします^1,2,3。骨格筋は、ミオパチー、ジストロフィー、サルコペニアなどの遺伝性および慢性疾患、および心血管代謝性疾患などの多くの非筋肉慢性疾患を含む多くの疾患の病態生理にも関連しています3,4,5,6,7,8。

健康と病気の文脈における成熟した骨格筋の構造的および機能的特性のex vivo研究は、主に2つの実験モデル、つまり全筋肉と孤立した繊維によって可能になりました。20^世紀には、研究者は、運動単位、繊維の種類、および収縮と弛緩の力と動力学などの動的特性について学ぶために、さまざまな小さ....

プロトコル

すべての手順は、コロンビア政府が発行した1989年の法律84および1993年の決議8430に従って、アンティオキア大学(UdeA)の動物実験倫理委員会(2016年6月21^日の議事録104、および2021年4月15日の005)によって承認され、動物実験に準拠して実行および報告されました。 In Vivo Experiments (ARRIVE) ガイドラインの報告⁴¹.ここで紹介するすべての結果は、健康な7-13週齢、20-26g、C57BL/6雄マウスからのものです。図1は、この研究の一般的なデザインと手順の順序を示しています。すべての試薬、材料、および機器の詳細は、材料表に記載されています。

1.動物

1. アクリル製の透明な長方形のケージにつき最大6匹のマウスを飼育し、木材由来の寝具を使用し、温度管理(21±〜2°C)と明暗(12:12時間)のサイクルで飼育します。
2. 環境を豊かにすることなく、特定の病原体のない動物施設で動物に餌と水道水を自由に利用できるようにします。

2.解剖

1. 溶液、....

ディスカッション

成熟した骨格筋生物学の研究に利用できるモデルを補完するために、ここでは、短繊維、中線維、長線維を持つさまざまなマウスの筋肉の酵素解離の成功を実証します。これらの繊維は、骨格筋における^Ca2+ トランジェントのMT-II動態の一般化可能性の実証を可能にする。また、インタクト中の繊維の種類は、筋肉全体を分類した。FDBが生理学的実験に最も使用される筋肉であること?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma Aldrich	32221
Acetone	Merck	179124
Acrylamide	Gibco BRL	15512-015
Ammonium persulfate	Panreac	141138.1610
Anti myosin I antibody	Sigma Aldrich	M4276	Primary antibody
Anti myosin II antibody	Sigma Aldrich	M8421	Primary antibody
Anti myosin IIA antibody	American Type Culture Collection	SC-71	Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	BF-F3-c	Primary antibody
Bis-acrylamide	AMRESCO	0172
Bovine serum albumin	Thermo Scientific	B14
Bradford reagent	Merck	1.10306.0500
Bromophenol blue	Carlo Erba	428658
Calcium carbonate	Merck	102066
Calcium dichloride (CaCl2)	Merck	2389
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
Collagenase type 2	Worthington	CLS-2/LS004176
Consul-Mount	Thermo Scientific	9990440
Coomassie Brilliant blue R 250	Merck	112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dithiothreitol (DTT)	AMRESCO	0281
Edetic acid (EDTA	AMRESCO	0322
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
Glycerol	Panreac	1423291211
Glycine	Panreac	151340.1067
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Hematoxylin	Thermo Scientific	6765015
HEPES	AMRESCO	0511
Hoechst 33258	Sigma Aldrich	861405
Imidazole	AMRESCO	M136
Isopentane	Sigma Aldrich	M32631
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Mag-Fluo-4, AM	Invitrogen	M14206	Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol	Applichem	A11080100
Methanol	Protokimica	MP10043
Mice	Several	Several	For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Promega	V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Tocris	1870
Optimal cutting compound (OCT)	Thermo Scientific	6769006
Secondary antibody	Thermo Scientific	A-11001	Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate	Panreac	1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8	AMRESCO	J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane	AMRESCO	M151
Triton X-100	AMRESCO	M143
Materials
Dissection chamber	Custom-made
Charged slides	Erie Scientific	5951PLUS
Experimental bath chamber	Warner Instruments	RC-27NE2	Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps	World Precision Instruments	500338, 500230
Fine scissors	World Precision Instruments	Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes	Several		Fire-polished tips
Glass vials with cap	Several		2-3 mL volumen
Operating scissors	World Precision Instruments	501223-G
Equipment
Centrifuge	Thermo Scientific	SL 8R
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cryostat	Leica	CM1850
Digital camera	Zeiss	Erc 5s and Axio 305	Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer	Molecular Devices	1550A Digidata
Electrophoresis chamber	Bio Rad	Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence	Zeiss	Axio Observer A1	Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier	Horiba	R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba	Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope	Zeiss	Stemi 508
Stimulator	Grass Instruments	S6
Water bath	Memmert	WNE-22
Xilol	Sigma Aldrich	808691
Software
Free software for electrophoreses analyses	University of Kentucky	GelBandFitter v1.7	http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry	National Institutes of Health	ImageJ v1.54	https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses	Molecular Devices	pCLAMP v10.05	https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing	OriginLab	OriginPro 2019	https://www.originlab.com/