小鼠左肺肺门钳夹模型治疗肺缺血再灌注损伤

摘要

该协议概述了一种可行、可靠和可重复的左肺门钳夹方法，可用于研究小鼠模型中的肺缺血再灌注损伤。

摘要

肺移植期间的缺血再灌注损伤 （IRI） 是移植后并发症的主要危险因素，包括原发性移植物功能障碍、急性和慢性排斥反应以及死亡率。研究 IRI 基础的努力导致了可靠且可重复的左肺门钳夹小鼠模型的开发。该模型涉及在麻醉和插管小鼠中进行的外科手术。进行左胸切开术，然后仔细进行肺活动并清扫左肺门。肺门钳夹术涉及用滑结对肺门进行可逆缝合结扎术，以阻止动脉流入、静脉流出和气流通过左主支气管。再灌注是通过小心地移除缝合线开始的。在目前的研究中，我们的实验室使用 30 分钟的缺血和 1 小时的再灌注作为实验模型。但是，这些时间段可以根据特定的实验问题进行修改。在处死前，在右肺门钳夹 4 分钟后，可以从左心室获得动脉血气，以确保获得的 PaO₂ 值仅归因于受伤的左肺。我们还描述了一种用流式细胞术测量细胞外渗的方法，该方法涉及在处死前静脉注射对要研究的细胞具有特异性的荧光染料标记的抗体。然后可以收集左肺进行流式细胞术、冷冻或固定、石蜡包埋的免疫组织化学和定量聚合酶链反应。这种肺门钳夹技术可以详细研究 IRI 背后的细胞和分子机制。代表性结果显示肺门钳夹术后左肺氧合减少和肺损伤的组织学证据。无论有没有显微外科经验的人员都可以很容易地学习和复制该技术，从而获得可靠和一致的结果，并作为研究肺部 IRI 的广泛采用模型。

引言

器官移植期间的 IRI 是原发性移植物功能障碍和后续移植物排斥反应发作的主要危险因素 ^1,2。在移植过程中，热缺血时间定义为从供体主动脉交叉钳夹到开始冷灌注以及从器官从冰中取出到器官植入的时间段。冷藏时间定义为从开始冷灌注到器官从冰中取出的时间段³.温性缺血比冷性缺血对后期器官功能更有害 ^4,5,6，^其潜在机制值得在临床前模型中进一步研究。此外，与传统的脑死亡后捐献 （DBD） 相比，心源性死亡 （DCD） 捐献的器官移植与更长的热缺血时间相关⁷。虽然使用 DCD 供体可以扩大供体库并提高肺利用率，但需要进一步的临床前研究来评估温缺血对移植后肺功能的影响。下面，我们描述了通过左肺门钳夹在小鼠中温 IRI 的模型。

在过去几年中，已经开发和适应了几种肺门钳夹的动物模型，可能包括使用无创伤微血管钳夹 8,9,10,11,12,13

研究方案

所有研究均得到华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。根据美国国家科学院编写并由美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（第^{8 版 21} ）以及美国国家医学研究学会制定的《实验动物护理原则》，动物接受了人道关怀。

1.麻醉和插管

1. 选择重量至少为 25 克的鼠标。由于声带之间的孔口较大，这将有助于更容易插管。
2. 腹膜内注射小鼠氯胺酮（剂量100mg / kg体重）和甲苯噻嗪（剂量10mg / kg体重）的混合物。该混合物应装入带有 1/2 英寸 29G 针头的 2/2 cc 注射器中。等待大约 5 分钟让氯胺酮生效 - 小鼠不应表现出自发运动并且对脚趾捏合没有反应，这证实了充分的麻醉。
3. 手术前皮下注射丁丙诺啡（剂量 0.05 mg/kg 体重），以进一步控制疼痛。
4. 将非药物眼药膏涂抹在双眼上，以避免手术期间角膜干燥。
5. 用剪子在左胸部和背部剃须鼠标（见 图1A），如果计划进行剖腹手术，则延伸到腹部（见步骤5.3）。
6. 一旦小鼠被麻醉，使用首选的插管设置进行插管，并在显微镜下在~37°C的加热垫上进行剩余的过程（以维持小鼠的正常体温）。
7. 在获得足够的声带视野后，将末端带....

讨论

我们描述了一种肺门钳夹技术，该技术涉及在左肺门上应用滑结，该滑结阻塞肺动脉、静脉和支气管以诱导热缺血，然后进行再灌注。肺门钳夹后，可以采集左肺用于各种实验技术，如组织学、流式细胞术、批量或单细胞测序以及定量聚合酶链反应。此外，血液和脾脏可用于研究全身效应，而非缺血性右肺可用作内部对照。在该协议中，我们还描述了获得ABG测量值和/或确定细胞外渗的详细方法。.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection