小鼠左肺肺门钳夹模型治疗肺缺血再灌注损伤

摘要

该协议概述了一种可行、可靠和可重复的左肺门钳夹方法，可用于研究小鼠模型中的肺缺血再灌注损伤。

摘要

肺移植期间的缺血再灌注损伤 （IRI） 是移植后并发症的主要危险因素，包括原发性移植物功能障碍、急性和慢性排斥反应以及死亡率。研究 IRI 基础的努力导致了可靠且可重复的左肺门钳夹小鼠模型的开发。该模型涉及在麻醉和插管小鼠中进行的外科手术。进行左胸切开术，然后仔细进行肺活动并清扫左肺门。肺门钳夹术涉及用滑结对肺门进行可逆缝合结扎术，以阻止动脉流入、静脉流出和气流通过左主支气管。再灌注是通过小心地移除缝合线开始的。在目前的研究中，我们的实验室使用 30 分钟的缺血和 1 小时的再灌注作为实验模型。但是，这些时间段可以根据特定的实验问题进行修改。在处死前，在右肺门钳夹 4 分钟后，可以从左心室获得动脉血气，以确保获得的 PaO₂ 值仅归因于受伤的左肺。我们还描述了一种用流式细胞术测量细胞外渗的方法，该方法涉及在处死前静脉注射对要研究的细胞具有特异性的荧光染料标记的抗体。然后可以收集左肺进行流式细胞术、冷冻或固定、石蜡包埋的免疫组织化学和定量聚合酶链反应。这种肺门钳夹技术可以详细研究 IRI 背后的细胞和分子机制。代表性结果显示肺门钳夹术后左肺氧合减少和肺损伤的组织学证据。无论有没有显微外科经验的人员都可以很容易地学习和复制该技术，从而获得可靠和一致的结果，并作为研究肺部 IRI 的广泛采用模型。

引言

器官移植期间的 IRI 是原发性移植物功能障碍和后续移植物排斥反应发作的主要危险因素 ^1,2。在移植过程中，热缺血时间定义为从供体主动脉交叉钳夹到开始冷灌注以及从器官从冰中取出到器官植入的时间段。冷藏时间定义为从开始冷灌注到器官从冰中取出的时间段³.温性缺血比冷性缺血对后期器官功能更有害 ^4,5,6，^其潜在机制值得在临床前模型中进一步研究。此外，与传统的脑死亡后捐献 （DBD） 相比，心源性死亡 （DCD） 捐献的器官移植与更长的热缺血时间相关⁷。虽然使用 DCD 供体可以扩大供体库并提高肺利用率，但需要进一步的临床前研究来评估温缺血对移植后肺功能的影响。下面，我们描述了通过左肺门钳夹在小鼠中温 IRI 的模型。

在过去几年中，已经开发和适应了几种肺门钳夹的动物模型，可能包括使用无创伤微血管钳夹 8,9,10,11,12,13、Rumel 止血带 ^14,15 或缝合结扎¹⁶作为肺门夹。肺门钳夹的关键是它必须是可逆的，并且对肺门结构造成最小的损伤或不会造成损伤，以便实现再灌注。在这里，我们描述了我们在小鼠中的肺门钳夹技术，该技术涉及左肺门的可逆缝合结扎术，并用滑结结。这种方法阻塞了肺动脉流入、静脉流出和进出主支气管的气流。与血管夹、夹子或止血带相比，滑结的主要好处是，在长时间缺血期间，胸部可以闭合，从而最大限度地减少小鼠体内的不显性液体和热量损失。我们提供了一种方案，用于获得可靠的动脉血气 （ABG） 测量值和测量肺门钳夹后细胞外渗。

这种肺门钳夹技术在更广泛的肺移植研究中占有重要地位。与原位肺移植的小动物模型相比，肺门钳夹技术可以在不增加手术吻合口创伤或同种异体性的情况下隔离 IRI 的影响¹⁷。此外，与小鼠肺移植相比，肺门钳夹技术可以更容易、更快速地掌握。事实上，使用肺门钳夹技术，在过去十年中已经确定了IRI发病机制的几个重要机制，如TLR4、NADPH氧化酶和腺苷A2A受体14,18,19,20。在以下方案中，我们提出了一种可靠的、可教的和可重复的肺门钳夹方法，作为研究肺 IRI 的工具。

研究方案

所有研究均得到华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。根据美国国家科学院编写并由美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（第^{8 版 21} ）以及美国国家医学研究学会制定的《实验动物护理原则》，动物接受了人道关怀。

1.麻醉和插管

1. 选择重量至少为 25 克的鼠标。由于声带之间的孔口较大，这将有助于更容易插管。
2. 腹膜内注射小鼠氯胺酮（剂量100mg / kg体重）和甲苯噻嗪（剂量10mg / kg体重）的混合物。该混合物应装入带有 1/2 英寸 29G 针头的 2/2 cc 注射器中。等待大约 5 分钟让氯胺酮生效 - 小鼠不应表现出自发运动并且对脚趾捏合没有反应，这证实了充分的麻醉。
3. 手术前皮下注射丁丙诺啡（剂量 0.05 mg/kg 体重），以进一步控制疼痛。
4. 将非药物眼药膏涂抹在双眼上，以避免手术期间角膜干燥。
5. 用剪子在左胸部和背部剃须鼠标（见 图1A），如果计划进行剖腹手术，则延伸到腹部（见步骤5.3）。
6. 一旦小鼠被麻醉，使用首选的插管设置进行插管，并在显微镜下在~37°C的加热垫上进行剩余的过程（以维持小鼠的正常体温）。
7. 在获得足够的声带视野后，将末端带有曲线的自制导引器（见 补充图 1）插入 1 英寸的 20G 血管导管中，该导管用作气管插管 （ETT）。引导导引器的尖端，然后引导 ETT 在声带之间并经过声带。
   注意:重要的是要观察 ETT 穿过声带，以避免假插管进入食道。插管时应注意避免声带损伤（即，插管尝试次数应限制在 5 次以内，如果遇到阻力，则不应提前 ETT）。
8. 插入 ETT 后，取下导引器，并将 ETT 连接到小动物呼吸机。观察对称性胸部上升，以确认气管插管正确。呼吸机设置应为每分钟 100-105 次呼吸，吸入氧分数为 100%。潮气量为 0.35 mL，呼气末正压为 1 cm H₂O。
   注意:确保胸部而不是腹部上升，因为如果不及时纠正，意外食管插管将导致死亡。
9. 一旦确认就位，用一条 5 厘米的 1 英寸丝带将 ETT 固定在小鼠鼻子周围，确保与 ETT 和鼻子充分接触，这样 ETT 就不会从嘴里滑出（参见 图 1B-C）。
10. 为了在整个手术过程中保持足够的麻醉，应根据氧气流量给予 1%-1.5% 的异氟烷。

2. 开胸手术

1. 将鼠标置于右侧卧位，两只前爪都贴在左上角，右后爪贴在左下角，左后爪贴在右下角（见 图 2G 胶带）。
2. 用至少 3 轮交替的聚维酮碘对左胸皮肤进行消毒，然后使用 70% 酒精。
3. 在从前腋线到后腋线的第4^肋间隙 上进行切口，使用剪刀打开覆盖的皮肤（见 图2A）。^第 4 肋间隙位于腋窝中线腋窝下方约 1 厘米处。
4. 为尽量减少失血，请使用手持烧灼笔凝固皮下层和肌肉层内的可见血管。
5. 用剪刀沿着皮肤切口的长度将背阔肌和前锯肌急剧分开（见 图2B）。
6. 使用细弯曲的镊子，小心地抬高^第 4肋骨（注意不要伤害下面的肺），并在^第 5肋上方用细剪刀进行精确剪刀，以进入^第4肋 间隙（见 图2C）。在第^{5 根肋} 骨上方而不是第^{4 根肋} 骨下方进行开胸手术，以避免损伤肋间神经血管束。
7. 一旦胸膜腔负压消失并且肺从胸壁回缩，就将开胸手术向前和向后延伸，位于^第 5 肋骨上方的^第 4 肋间隙（见图 2D-E）。切口的整个长度应足够长以暴露整个肺，通常为 ~1 厘米。
   注意:如果开胸手术向前延伸太远，可能会发生乳内动脉出血 - 如果遇到，应进行烧灼以避免过多的血液流失。
8. 应用两个肋骨牵开器以展开肋骨空间，留出至少 1 cm² 的工作窗口以获得足够的可视化（见图 2F-G）。

3、肺门钳的应用

1. 使用双尖棉头涂抹器，通过抬高头侧，然后钝性地分开半透明的肺下韧带来动员左肺（见图 3A-B）。
   注意:如果在不撕裂肺部的情况下执行此操作具有挑战性，也可以使用细剪刀将下肺韧带急剧分开。
2. 将肺向前反射，以便可以看到左肺门后部。将一块 6-0 丝带剪至 ~10 厘米，并将该带的中点放在肺门后方（见 图 3C）。
3. 然后，向后翻转左肺，放在领带上，并向前拉领带的两端（见 图3D）。
4. 用领带的两个自由端（A 和 B）系一个器械，用镊子和弯曲的蚊子夹系一个可逆的滑结。请参阅步骤 3.4.1 和 3.4.2 中的详细说明。温暖的缺血时间从打结开始。一旦打结，左肺就不应再随着呼吸机的呼吸而充气。它应该变成淡白色，意味着灌注停止。
   注意:应注意确保结位于肺门的中间，避免无意中夹住左心房中央和肺实质外侧（见 图3F）。
   1. 用夹子在惯用手，镊子在非惯用手，用镊子握住A的末端，并将A的中点绕在闭合的夹子上一次（见 图3E）。
   2. 用夹子抓住 B 的中点，用双手拉动以收紧滑结。不要让 B 的末端穿过结，否则会使结不可逆。打结后，B 应该有一个从结发出的环，而 A 应该是直的（见 图 3F）。可以通过拉动 B 的末端来解开结。
5. 通过手动闭塞从 ETT 到呼吸机的流出管来确认支气管的充分闭塞，这应导致左肺不会充气（见 图 3G）。鉴于与软骨支气管相比，肺动脉和静脉的塌陷性增加，支气管闭塞被认为是血管闭塞。
6. 使用肺门钳夹后，使用 6-0 尼龙缝合线用一个简单的中断缝合缝合皮肤切口，以尽量减少热缺血期间的不显性液体流失。

4. 松开肺门钳

1. 在所需的热缺血期之后，轻轻拉动丝带的短自由端（ 图3F 和步骤3.4中的B）松开滑结。松开滑结后开始再灌注时间。
   注意:松开系带后，可以通过再次手动闭塞 ETT 流出来确认肺通气，这现在应该会导致左肺扩张。同样，肺的充气暗示了灌注，但是，它也可以通过肺粉红色来确认（见 图4A）。
2. 在再灌注期间，分三层闭合胸部，以尽量减少不显性损失。首先，用 6-0 尼龙缝合线单针闭合^第 4 肋骨空间，在第^{4 根肋}骨上方咬一口，在第^{6 根肋}骨上方咬一口（见图 4B-C）。将其与最大肺充气联系起来，以最大限度地降低医源性气胸的风险（见图4D-E）。
3. 接下来，使用带有 6-0 尼龙缝合线的简单缝合线闭合肌肉层。
4. 最后，用 6-0 尼龙缝合线进行简单的断续缝合，闭合皮肤切口（见 图 4F）。避免在皮肤上缝合，因为有清醒的动物会抠其切口并导致伤口完全裂开的风险。
5. 从这一点开始，可以在所需的再灌注时间结束时直接收获肺。如果需要进行动脉血气分析，请参阅步骤 5。如果需要在处死前进行额外的静脉注射，请参阅步骤 6。这是一项终末手术。
6. 如果再灌注时间超过几个小时，请关闭异氟醚，让小鼠从麻醉中醒来并拔管。拔管标准包括爪子抽搐、捏合以及自主呼吸和运动。从氯胺酮和异氟醚麻醉中唤醒小鼠通常需要 30-45 分钟。这是一项生存手术。
   1. 对于生存手术，皮下注射 1 mL 温盐水，以解决手术造成的液体流失。手术前皮下注射丁丙诺啡（剂量 0.05 - 0.1 mg/kg 体重）以控制疼痛。手术后至少 3 天每 4-6 小时重复麻醉一次。考虑沿切口使用布比卡因阻滞剂，以进一步控制疼痛。

5. 动脉血气分析

注意:如果需要 ABG 测量，最好通过左心室的动脉血抽吸来获得。为了确定动脉血气图仅反映左肺功能，应在右肺门夹夹约 4 分钟后获取动脉血^22,23，在此期间只有左肺进行氧合和通气。

1. 如果小鼠在肺门钳夹后从麻醉中醒来，则根据步骤 1 重新麻醉并插管小鼠。
2. 在所需的再灌注时间结束前约15-20分钟，将小鼠置于仰卧位，用胶带固定所有四个肢体。
   注意:在再灌注结束之前，应为以下步骤分配足够的时间。打开腹部和胸部的具体时间将根据外科医生和他们的经验而有所不同。
3. 从耻骨到剑突进行中线剖腹手术，用剪刀切开皮肤，然后沿着白线切开腹壁（见图5A-B）。
4. 在剑突处，沿着最下肋骨的曲线，将剖腹手术向左和向右延伸到前腋线（见 图5C）。
5. 从腹部切开中线的前横膈膜进入胸部，注意不要太深，以免伤害心脏（见图5D-E）。然后，将前横膈膜切口左右延伸到前腋线，沿着最下方的肋骨（参见图5D中的白色虚线）。
6. 沿前腋线分割双侧肋骨，向上延伸至腋窝，进行翻盖式开胸术。然后，反射前胸壁（胸骨和双侧前肋骨）头侧，使心脏和双侧肺完全暴露（参见 图5F中的白色虚线）。
7. 将夹子夹在前胸壁上，该胸壁呈头侧翻转，以利于回缩。用弯曲的蚊子夹将横膈膜向下缩回amp 在中线以改善胸部的可见性（见 图 5F）。
8. 为了完全动员右肺（有 4 个肺叶），将延伸到左胸部中线的副肺叶返回到右胸部（见图 5G-H）。有一条细韧带将这个耳垂连接到左胸部 - 用棉头涂抹器钝切地分开，或者用剪刀尖锐地分开。
   注意:该副叶穿过下腔静脉 （IVC） 后方的中线，因此在此操作过程中必须注意不要伤害 IVC。
9. 一旦所有肺叶都回到右胸，将整个右肺向前反射，并在右肺门后方放置另一根 6-0 丝带（切至 ~10 厘米）。然后，将右肺置换回胸腔，穿过领带。
10. 使用与步骤 3.4 中描述的相同技术在右肺门上系另一个滑结，注意环绕右肺的所有四个肺叶。这个右肺门钳夹步骤的时间应在再灌注结束前约 4 分钟。
11. 在 1 cc 结核菌素注射器上涂有约 200 μL 1000 单位/mL 肝素的 1/2 英寸 31G 针头。为此，吸取肝素的体积并反复来回拉动柱塞 3-4 次，以使肝素覆盖注射器的整个内部。这样做是为了最大限度地降低从手术站运输到 ABG 机器时吸入的血液凝固的风险。
12. 右肺门钳夹4分钟后，将左心室的动脉血吸入肝素包被的注射器中（见图5I）。注意避免刺穿室间隔和无意中抽吸右心室静脉血。较深的右心室和较亮的左心室之间存在明显的颜色差异（见图5I插图）。将针头朝向左侧颈部。可能需要多次穿刺才能获得足够的血液来进行 ABG （~150 μL）。
    注意:在右肺门钳夹的 4 分钟内，小鼠可能会开始表现出痛苦的呼吸，这预示着即将死亡。如果发生这种情况，应在心脏骤停之前迅速抽吸动脉血。不可能从不跳动的心脏中吸出血液。
13. 在动脉血气分析机上运行动脉血，以获得氧饱和度、氧分压、二氧化碳分压等测量值。在ABG收集和/或抗体治疗后对小鼠实施安乐死（参见步骤6）。

6.静脉注射抗体，用于测量细胞外渗

注:该技术可用于通过在处死前将荧光染料标记的抗体静脉注射到 IVC 中来确定细胞外渗，然后进行流式细胞术分析，如先前发表的¹⁸。简而言之，可以使用中性粒细胞特异性抗 Ly6G 抗体来区分血管内中性粒细胞和间质性中性粒细胞。异硫氰酸荧光素标记（FITC 标记）抗 Ly6G（克隆 1A8）在处死前 5 分钟静脉注射，标记循环血管内中性粒细胞。使用的 FITC-Ly6G 抗体的浓度为 100 ng，在 200 μL 磷酸盐缓冲盐水中稀释。然后，在制备来自左肺的单细胞悬液用于流式细胞术后，用别藻蓝蛋白标记（APC标记）的抗Ly6G（克隆1A8）标记所有中性粒细胞。因此，APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G⁺ 中性粒细胞是血管内粒细胞，而 APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G^- 是血管外或间质细胞。例如，该技术可以适用于具有抗Ly6C抗体的单核细胞，具有抗CD19抗体的B细胞。

1. 将所需的抗体装入带有 5/16 英寸 31G 针头的 3/10 cc 注射器中，注意尽量减少注射器内的气泡。在步骤 6.5 中将其用于静脉注射到 IVC 中。
2. 根据步骤 5.3-5.4 进行剖腹手术。
3. 剖腹手术后，使用两个尖头棉头涂抹器钝性地进行右内内侧内脏旋转。在小鼠中，这是通过切除腹部左侧的所有肠道来完成的，这将允许清楚地看到IVC（见 图6A）。
4. 用棉签涂抹器钝性地清除覆盖在 IVC 上的脂肪。
5. 通过静脉穿刺将抗体溶液注射到IVC中（见 图6B）。拔出针头后，立即用棉签轻轻按压静脉穿刺部位，直至止血（通常约2-3分钟）。
6. 通过棉签将内脏肠放回腹部，继续对IVC施加压力（见 图6C）。
7. 按照步骤5.5-5.7进行翻盖式开胸手术，收获左肺。在处死和收获之前，让抗体至少有 5 分钟的全身循环。在 ABG 收集和/或抗体治疗后对小鼠实施安乐死。

7. 组织学 （H&E） 染色

1. 在福尔马林固定和左肺石蜡包埋并切片至5μm厚度后，在二甲苯中脱蜡载玻片（两次10分钟洗涤）。
2. 顺序乙醇洗涤中的脱水:用 100% 洗涤 2x 5 分钟，用 95% 洗涤 1x 2 分钟，用 70% 乙醇洗涤 1x 2 分钟。然后，用去离子水冲洗。
3. 用苏木精染色载玻片 2-4 分钟，然后用去离子水洗涤 5 分钟或直到它变得清澈。苏木精染色的精确持续时间需要根据组织和所需的核染色强度进行优化。
4. 在定义溶液中洗涤 30 秒以区分污渍，然后在水中洗涤 2 分钟。在蓝色形成溶液中洗涤 30 秒，然后在水中洗涤 2 分钟。
5. 通过浸入 95% 乙醇 15 次进一步脱水。在曙红中染色 1 分钟。
6. 用2分钟乙醇洗涤（2x）脱水，然后用2分钟二甲苯洗涤（2x）脱水。涂抹安装介质并盖上盖玻片。

结果

左肺门钳夹后，归因于左肺的动脉血氧合分压 （PaO₂） 为 ~100 mmHg，与假开胸手术后的 ~500 mmHg 相比显着降低（图 7A，n=6-7）。值得注意的是，在 B6 小鼠中进行了假开胸手术，在右肺门钳夹 4 分钟后进行 ABG 测量，代表仅归因于左肺的值。肺门钳夹左肺的H&E染色显示浸润的炎症细胞充满气道和血管充血红细胞，而这些发现在幼稚的左肺中不存在（图7B，n...

讨论

我们描述了一种肺门钳夹技术，该技术涉及在左肺门上应用滑结，该滑结阻塞肺动脉、静脉和支气管以诱导热缺血，然后进行再灌注。肺门钳夹后，可以采集左肺用于各种实验技术，如组织学、流式细胞术、批量或单细胞测序以及定量聚合酶链反应。此外，血液和脾脏可用于研究全身效应，而非缺血性右肺可用作内部对照。在该协议中，我们还描述了获得ABG测量值和/或确定细胞外渗的详细方法。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection