Modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión

Resumen

El protocolo describe un método factible, fiable y reproducible de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo que puede utilizarse para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión pulmonar en modelos de ratón.

Resumen

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) durante el trasplante de pulmón es un factor de riesgo importante para las complicaciones posteriores al trasplante, incluida la disfunción primaria del injerto, el rechazo agudo y crónico y la mortalidad. Los esfuerzos para estudiar los fundamentos de la IRI condujeron al desarrollo de un modelo de ratón fiable y reproducible de pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo. Este modelo consiste en un procedimiento quirúrgico realizado en un ratón anestesiado e intubado. Se realiza una toracotomía izquierda, seguida de una movilización pulmonar cuidadosa y disección del hilio pulmonar izquierdo. La pinza hiliar implica la ligadura reversible del hilio pulmonar con un nudo corredizo, que detiene la entrada arterial, la salida venosa y el flujo de aire a través del bronquio principal izquierdo. La reperfusión se inicia mediante la extracción cuidadosa de la sutura. Nuestro laboratorio utiliza 30 min de isquemia y 1 h de reperfusión para el modelo experimental en las investigaciones actuales. Sin embargo, estos períodos de tiempo pueden modificarse dependiendo de la pregunta experimental específica. Inmediatamente antes del sacrificio, se puede obtener gasometría arterial del ventrículo izquierdo después de un período de 4 minutos de pinzamiento del hilar derecho para garantizar que los valores de_PaO2 obtenidos se atribuyan solo al pulmón izquierdo lesionado. También describimos un método para medir la extravasación celular con citometría de flujo, que implica la inyección intravenosa de un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para la(s) célula(s) que se va a estudiar antes del sacrificio. A continuación, se puede extraer el pulmón izquierdo para la citometría de flujo, congelado o fijo, inmunohistoquímica incluida en parafina y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Esta técnica de pinzamiento hiliar permite un estudio detallado de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la IRI. Los resultados representativos revelan una disminución de la oxigenación del pulmón izquierdo y evidencia histológica de lesión pulmonar después del pinzamiento hiliare. Esta técnica puede ser fácilmente aprendida y reproducida por personal con y sin experiencia microquirúrgica, lo que conduce a resultados confiables y consistentes y sirve como un modelo ampliamente adoptable para el estudio de la IRI pulmonar.

Introducción

La IRI durante el trasplante de órganos es un factor de riesgo importante para la disfunción primaria del injerto y los episodios posteriores de rechazo del injerto ^1,2. Durante el trasplante, el tiempo de isquemia caliente se define como el período de tiempo que transcurre desde el pinzamiento cruzado de la aorta del donante hasta el inicio de la perfusión fría y desde la extracción del órgano desde el hielo hasta la implantación del órgano. El tiempo de almacenamiento en frío se define como el período de tiempo que transcurre desde el inicio de la perfusión en frío hasta la extracción del órgano del hielo³. La isquemia caliente es más deletérea para la función orgánica posterior que la isquemia fría ^4,5,6, y sus mecanismos subyacentes justifican estudios adicionales en modelos preclínicos. Además, el trasplante de órganos por donación después de la muerte cardíaca (DCD) se asocia con tiempos isquémicos cálidos más largos que la donación tradicional después de la muerte encefálica (DBD)⁷. Si bien el uso de donantes con DCD puede ampliar el grupo de donantes y aumentar la utilización pulmonar, se necesitan más estudios preclínicos para evaluar los efectos de la isquemia caliente en la función pulmonar posterior al trasplante. A continuación, describimos un modelo de IRI caliente en ratones a través de la pinza hiliar pulmonar izquierda.

En los últimos años se han desarrollado y adaptado varios modelos animales de pinzamiento hiliar pulmonar que pueden incluir el uso de una pinza microvascular atraumática 8,9,10,11,12,13, un torniquete de Rumel ^14,15 o una ligadura de sutura¹⁶ como la pinza hiliare. El quid de la pinza hiiar es que debe ser reversible y causar un daño mínimo o nulo a las estructuras hiliares para que se pueda lograr la reperfusión. Aquí, describimos nuestra técnica de pinzamiento hiliar en ratones que implica la ligadura reversible de sutura del hilio pulmonar izquierdo con un nudo corredizo. Este método ocluye el flujo arterial pulmonar de entrada, el flujo venoso de salida y el flujo de aire dentro y fuera del bronquio principal. El principal beneficio de un nudo corredizo sobre una pinza vascular, un clip o un torniquete es que el tórax puede cerrarse durante períodos prolongados de isquemia, minimizando así la pérdida de líquido insensible y calor en el ratón. Proporcionamos un protocolo para obtener mediciones fiables de la gasometría arterial (GAB) y para medir la extravasación celular después del pinzamiento hiliar.

Esta técnica de pinzamiento hiliar ocupa un lugar importante en el estudio más amplio del trasplante de pulmón. En comparación con los modelos de trasplante pulmonar ortotópico de animales pequeños, la técnica de pinzamiento hiliar puede aislar los efectos de la IRI sin la adición de trauma anastomótico quirúrgico o alogenicidad¹⁷. Además, la técnica de pinzamiento hiliar puede dominarse más fácil y rápidamente que el trasplante de pulmón de ratón. De hecho, utilizando técnicas de pinzamiento hiliar, se han identificado en la última década varios mecanismos importantes en la patogénesis de la IRI, como TLR4, NADPH oxidasa y el receptor de adenosina A2A 14,18,19,20. En el siguiente protocolo, presentamos un método fiable, enseñable y reproducible de pinzamiento hiliar como herramienta para el estudio de la IRI pulmonar.

Protocolo

Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Los animales recibieron cuidados humanitarios de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio,^8ª edición²¹ preparada por la Academia Nacional de Ciencias y publicada por los Institutos Nacionales de Salud, y los Principios de cuidado de animales de laboratorio formulados por la Sociedad Nacional de Investigación Médica.

1. Anestesia e intubación

1. Seleccione un ratón que pese al menos 25 g. Esto facilitará la intubación debido al orificio más grande entre las cuerdas vocales.
2. Inyectar al ratón por vía intraperitoneal una mezcla de ketamina (dosis de 100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (dosis de 10 mg/kg de peso corporal). Esta mezcla debe cargarse en una jeringa de 1/2 cc con una aguja 29G de 1/2 pulgada. Espere unos 5 minutos para que la ketamina haga efecto: el ratón no debe mostrar movimiento espontáneo y no responde a un pellizco en el dedo del pie, lo que confirma una anestesia adecuada.
3. Inyecte buprenorfina (dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea antes de la cirugía para un control adicional del dolor.
4. Aplique un ungüento oftálmico no medicado sobre ambos ojos para evitar la desecación de la córnea durante la cirugía.
5. Afeitar el ratón con una maquinilla sobre el pecho izquierdo y la espalda (véase la figura 1A), extendiéndolo hasta el abdomen si se planea una laparotomía (véase el paso 5.3).
6. Una vez que el ratón esté anestesiado, realice la intubación utilizando una configuración de intubación preferida y el resto del procedimiento bajo un microscopio sobre una esterilla calentada a ~ 37 °C (para mantener la normotermia en el ratón).
7. Después de lograr una visión adecuada de las cuerdas vocales, inserte un introductor casero (ver Figura complementaria 1) con una curva en el extremo en un angiocatéter 20G de 1 pulgada, que se utiliza como tubo endotraqueal (TET). Guíe la punta del introductor y luego el ETT entre y más allá de las cuerdas vocales.
   NOTA: Es importante visualizar el TET atravesando las cuerdas vocales para evitar una falsa intubación en el esófago. Se debe tener cuidado para evitar lesiones en las cuerdas vocales durante la intubación (es decir, el número de intentos de intubación debe limitarse a 5 y el TET no debe adelantarse si se encuentra resistencia).
8. Una vez que se inserte el ETT, retire el introductor y conéctelo a un ventilador para animales pequeños. Observar la elevación simétrica del tórax para confirmar la correcta intubación endotraqueal. Los ajustes del ventilador deben ser de 100 a 105 respiraciones por minuto y la fracción de oxígeno inspirado del 100%. El volumen corriente es de 0,35 mL y la presión positiva al final de la espiración es de 1 cm H₂O.
   NOTA: Asegúrese de que el tórax en lugar del abdomen esté subiendo, ya que la intubación esofágica accidental provocará la muerte si no se corrige rápidamente.
9. Una vez que se haya confirmado que está en posición, asegure el ETT con una tira de 5 cm de cinta de seda de 1 pulgada alrededor de la nariz del ratón, asegurando un contacto adecuado con el ETT y la nariz para que el ETT no se deslice fuera de la boca (consulte la Figura 1B-C).
10. Para mantener una anestesia adecuada durante toda la cirugía, administre isoflurano al 1%-1,5% en línea con el flujo de oxígeno.

2. Toracotomía

1. Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho, con ambas patas delanteras pegadas a la esquina superior izquierda, la pata trasera derecha pegada a la esquina inferior izquierda y la pata trasera izquierda pegada a la esquina inferior derecha (consulte la Figura 2G para ver la cinta).
2. Desinfectar con piel sobre el tórax izquierdo con al menos 3 rondas alternas de povidona yodada seguidas de la aplicación de alcohol al 70%.
3. Realice una incisión en el^4º espacio intercostal desde la línea axilar anterior hasta la línea axilar posterior, utilizando tijeras para abrir la piel suprayacente (véase la figura 2A). El^4º espacio intercostal se encuentra aproximadamente 1 cm por debajo de la axila en la línea axilar media.
4. Para minimizar la pérdida de sangre, coagule los vasos sanguíneos visibles dentro de las capas subcutáneas y musculares con una pluma de cauterización manual.
5. Divida bruscamente los músculos dorsal ancho y serrato anterior con unas tijeras a lo largo de la incisión cutánea (véase la figura 2B).
6. Con pinzas curvas finas, eleve cuidadosamente la^4.ª costilla (teniendo cuidado de no lesionar el pulmón subyacente) y haga un corte preciso con unas tijeras finas justo por encima de la^5.ª costilla para entrar en el^4.º espacio intercostal (véase la figura 2C). Realizar la toracotomía por encima de la^5ª costilla en lugar de por debajo de la^4ª costilla para evitar lesionar el haz neurovascular intercostal.
7. Una vez que se pierde la presión negativa de la cavidad pleural y el pulmón se retrae de la pared torácica, extienda la toracotomía anterior y posteriormente en el^4º espacio intercostal justo por encima de la^5ª costilla (ver figura 2D-E). Toda la longitud de la incisión debe ser lo suficientemente larga como para exponer todo el pulmón, generalmente ~ 1 cm.
   NOTA: El sangrado interno de la arteria mamaria puede ocurrir si la toracotomía se extiende demasiado hacia atrás; si se encuentra, debe cauterizarse para evitar una pérdida excesiva de sangre.
8. Aplique dos retractores de nervaduras para abrir el espacio de la nervadura, permitiendo una ventana de trabajo de al menos 1^cm2 para una visualización adecuada (consulte la Figura 2F-G).

3. Aplicación de pinza hiliar

1. Con aplicadores de dos puntas con punta de algodón, movilice el pulmón izquierdo elevándolo cefálico y luego dividiendo bruscamente el ligamento pulmonar inferior translúcido (véase la figura 3A-B).
   NOTA: Si esto es difícil de realizar sin desgarrar el pulmón, el ligamento pulmonar inferior también se puede dividir bruscamente con tijeras finas.
2. Refleja el pulmón anteriormente para que se pueda visualizar el hilio pulmonar izquierdo posterior. Corte un trozo de corbata de seda 6-0 a ~10 cm y coloque el punto medio de esta corbata posterior al hilio (ver Figura 3C).
3. A continuación, voltee el pulmón izquierdo hacia atrás para colocarlo sobre la atadura y tire de ambos extremos de la atadura hacia delante (véase la figura 3D).
4. Con los dos extremos libres (A y B) de la corbata, ame un nudo corredizo reversible con pinzas y una pinza antimosquitos curvada. Véase la descripción detallada en los pasos 3.4.1 y 3.4.2. El tiempo isquémico caliente comienza con el atado del nudo corredizo. El pulmón izquierdo ya no debería inflarse con cada respiración del ventilador una vez que se ata el nudo. Debe volverse de color blanco pálido, lo que implica el cese de la perfusión.
   NOTA: Se debe tener cuidado para asegurarse de que el nudo se asiente en el medio del hilio, evitando atrapar inadvertidamente la aurícula izquierda centralmente y el parénquima pulmonar lateralmente (ver Figura 3F).
   1. Con la pinza en la mano dominante y las pinzas en la mano no dominante, sujete el extremo de A con pinzas y enrolle el punto medio de A alrededor de la pinza cerrada una vez (véase la figura 3E).
   2. Agarre el punto medio de B con la abrazadera y tire con ambas manos para sujetar el nudo corredizo. No dejes que el extremo de B atraviese el nudo, lo que haría que el nudo fuera irreversible. Después de atar el nudo, B debe tener un lazo que emane del nudo, mientras que A debe ser recto (ver Figura 3F). El nudo se puede soltar tirando del extremo de B.
5. Confirme la oclusión adecuada del bronquio ocluyendo manualmente el tubo de salida del TET al ventilador, lo que debería hacer que el pulmón izquierdo no se infle (véase la figura 3G). La oclusión vascular se asume con oclusión bronquial dada la mayor colapsabilidad de la arteria y las venas pulmonares en comparación con el bronquio cartilaginoso.
6. Después de la aplicación de la pinza hiliare, cierre la incisión cutánea con una simple puntada interrumpida utilizando sutura de nailon 6-0, para minimizar las pérdidas insensibles de líquido durante el período de isquemia caliente.

4. Liberación de la pinza hiiar

1. Después del período deseado de isquemia caliente, suelte el nudo corredizo tirando suavemente del extremo libre corto de la corbata de seda (B de la Figura 3F y el paso 3.4). Inicie el tiempo de reperfusión al soltar el nudo corredizo.
   NOTA: Después de la liberación de la atadura, la ventilación pulmonar puede confirmarse mediante una oclusión manual nuevamente del flujo de salida del TET, lo que ahora debería causar la expansión del pulmón izquierdo. Una vez más, la perfusión está implícita en la insuflación del pulmón, sin embargo, también puede confirmarse por el enrojecimiento del pulmón (véase la figura 4A).
2. Durante el período de reperfusión, cierre el tórax en tres capas para minimizar las pérdidas insensibles. Primero, cierre el espacio de la^4ª costilla con un solo punto con sutura de nailon 6-0, con un bocado justo por encima de la^4ª costilla y un bocado justo por encima de la^6ª costilla (véase la Figura 4B-C). Úntelo a la máxima inflación pulmonar, para minimizar el riesgo de un neumotórax iatrogénico (ver Figura 4D-E).
3. A continuación, cierra la capa muscular con un simple punto corrido con sutura de nailon 6-0.
4. Finalmente, cierre la incisión en la piel con una sutura interrumpida simple con sutura de nailon 6-0 (véase la figura 4F). Evite colocar puntos de sutura en la piel debido al riesgo de que los animales despiertos hurguen en su incisión y provoquen una dehiscencia completa de la herida.
5. A partir de este punto, el pulmón se puede extraer directamente al final del tiempo de reperfusión deseado. Si se desea la evaluación de ABG, consulte el paso 5. Si se desea una inyección intravenosa adicional antes del sacrificio, consulte el paso 6. Se trata de una cirugía terminal.
6. Si se pretende que el tiempo de reperfusión sea superior a un par de horas, apague el isoflurano para permitir que el ratón se despierte de la anestesia y se extubar. Los criterios de extubación incluyen espasmos con pellizco de la pata y respiraciones y movimientos espontáneos. Despertar a un ratón de la anestesia con ketamina e isoflurano suele tardar entre 30 y 45 minutos. Se trata de una cirugía de supervivencia.
   1. Para la cirugía de supervivencia, inyecte 1 ml de solución salina tibia por vía subcutánea para compensar las pérdidas de líquido de la cirugía. Inyecte buprenorfina (dosis de 0,05 a 0,1 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea antes de la cirugía para controlar el dolor. Repita la anestesia cada 4-6 h durante al menos 3 días después de la cirugía. Considere la posibilidad de colocar un bloqueo de bupivacaína a lo largo de la incisión para controlar el dolor de manera adicional.

5. Evaluación ABG

NOTA: Si se desea la medición de la presión arterial arterial, lo mejor es obtenerla mediante aspiración de sangre arterial desde el ventrículo izquierdo. Para cerciorarse de que la GA refleja solamente la función pulmonar izquierda, esta sangre arterial debe obtenerse después de unos 4 min de pinzamiento del hilio derecho^22,23, tiempo durante el cual sólo el pulmón izquierdo realiza la oxigenación y ventilación.

1. Si el ratón ha sido despertado de la anestesia después de la pinza hiilar, vuelva a anestesiar e intubar al ratón de acuerdo con el paso 1.
2. Unos 15-20 minutos antes del final del tiempo de reperfusión deseado, coloque el ratón en decúbito supino, asegurando las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
   NOTA: Se debe asignar suficiente tiempo para realizar los siguientes pasos antes del final de la reperfusión. El momento específico para abrir el abdomen y el tórax variará según el cirujano y su experiencia.
3. Realizar laparotomía de la línea media desde el hueso púbico hasta el xifoides, incidiendo con tijeras la piel seguida de la pared abdominal a lo largo de la línea alba (ver figura 5A-B).
4. En la xifoides, extender la laparotomía de izquierda a derecha hasta la línea axilar anterior, siguiendo la curva de la costilla más inferior (ver Figura 5C).
5. Desde el abdomen, haga una incisión en el diafragma anterior en la línea media para entrar en el tórax, teniendo cuidado de no profundizar demasiado para evitar lesionar el corazón (véase la figura 5D-E). Luego, extienda la incisión del diafragma anterior hacia la izquierda y hacia la derecha hasta la línea axilar anterior, a lo largo de la costilla más inferior (vea la línea punteada blanca en la Figura 5D).
6. Divida las costillas bilaterales a lo largo de la línea axilar anterior, extendiéndose hacia arriba hacia la axila, para crear una toracotomía en forma de concha. Luego, refleje la pared torácica anterior (esternón y costillas anteriores bilaterales) cefálica, lo que permite la exposición completa del corazón y los pulmones bilaterales (ver líneas punteadas blancas en la Figura 5F).
7. Aplique una pinza en la pared torácica anterior que está volteada para facilitar la retracción. Retraiga el diafragma hacia abajo con una pinza antimosquitos curvada en la línea media para mejorar la visualización del tórax (véase la figura 5F).
8. Para movilizar completamente el pulmón derecho (que tiene 4 lóbulos), regrese el lóbulo accesorio que se extiende más allá de la línea media hacia el tórax izquierdo y vuelva al tórax derecho (véase la figura 5G-H). Hay un ligamento delgado que une este lóbulo al pecho izquierdo: divídalo sin rodeos con aplicadores con punta de algodón o bruscamente con tijeras.
   NOTA: Este lóbulo accesorio cruza la línea media posterior a la vena cava inferior (VCI), por lo que se debe tener cuidado de no lesionar la VCI durante esta maniobra.
9. Una vez que todos los lóbulos hayan regresado al tórax derecho, refleje todo el pulmón derecho anteriormente y coloque otra corbata de seda 6-0 (cortada a ~ 10 cm) posterior al hilio derecho. Luego, vuelva a colocar el pulmón derecho en el tórax sobre la corbata.
10. Ata otro nudo corredizo alrededor del hilio derecho usando la misma técnica que se describe en el paso 3.4, teniendo cuidado de rodear los cuatro lóbulos del pulmón derecho. Este paso de pinza hiliar derecha debe programarse para que sea aproximadamente 4 minutos antes del final de la reperfusión.
11. Cubra una aguja 31G de 1/2 pulgada en una jeringa de tuberculina de 1 cc con aproximadamente 200 μL de heparina 1000 unidades/mL. Para hacer esto, aumente el volumen de heparina y tire repetidamente del émbolo hacia adelante y hacia atrás 3-4 veces para permitir que la heparina cubra todo el interior de la jeringa. Esto se hace para minimizar el riesgo de coagulación de la sangre aspirada durante el transporte desde la estación quirúrgica hasta la máquina ABG.
12. Después de 4 min de pinzamiento del hiliar derecho, aspire la sangre arterial del ventrículo izquierdo a la jeringa recubierta de heparina (véase la figura 5I). Tenga cuidado de evitar perforar el tabique ventricular y aspirar inadvertidamente sangre venosa del ventrículo derecho. Hay una clara diferencia de color entre el ventrículo derecho más oscuro y el ventrículo izquierdo más brillante (véase el recuadro de la Figura 5I). Inclina la aguja hacia el cuello izquierdo. Es posible que se requieran múltiples punciones para obtener suficiente sangre para ejecutar un ABG (~ 150 μL).
    NOTA: Durante los 4 minutos de pinzamiento del hilar derecho, el ratón puede comenzar a exhibir una respiración agónica que anuncia la muerte inminente. Si esto ocurre, la sangre arterial debe aspirarse rápidamente antes de un paro cardíaco. No es posible aspirar sangre de un corazón que no late.
13. Ejecute la sangre arterial en una máquina de ABG para obtener la saturación de oxígeno, la presión parcial de oxígeno, la presión parcial de dióxido de carbono, entre otras mediciones. Eutanasiar al ratón después de la recolección de ABG y/o el tratamiento con anticuerpos (ver paso 6).

6. Inyección intravenosa de anticuerpos para la medición de la extravasación celular

NOTA: Esta técnica se puede utilizar para determinar la extravasación celular a través de la inyección de anticuerpos marcados con fluorocromo por vía intravenosa en la VCI antes del sacrificio, seguido de un análisis de citometría de flujo, como se publicó anteriormente¹⁸. En resumen, los neutrófilos intravasculares se pueden distinguir de los neutrófilos intersticiales utilizando anticuerpos anti-Ly6G específicos de neutrófilos. El anti-Ly6G (clon 1A8) marcado con isotiocianato de fluoresceína (marcado con FITC) se inyecta por vía intravenosa 5 minutos antes del sacrificio, lo que marca los neutrófilos intravasculares circulantes. La concentración del anticuerpo FITC-Ly6G utilizada es de 100 ng diluidos en 200 μL de solución salina tamponada con fosfato. Luego, después de la preparación de la suspensión unicelular del pulmón izquierdo para la citometría de flujo, todos los neutrófilos se marcan con aloficocianina (marcado con APC) anti-Ly6G (clon 1A8). Así, los neutrófilos APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G⁺ son intravasculares, mientras que los APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G^- son extravasculares o intersticiales. Esta técnica se puede adaptar a monocitos con anticuerpos anti-Ly6C, células B con anticuerpos anti-CD19, por ejemplo.

1. Cargue el anticuerpo deseado en una jeringa de 3/10 cc con aguja 31G de 5/16 de pulgada, teniendo cuidado de minimizar las burbujas de aire dentro de la jeringa. Utilícelo para la inyección intravenosa en la VCI en el paso 6.5.
2. Realice la laparotomía de acuerdo con los pasos 5.3-5.4.
3. Después de la laparotomía, realice la rotación visceral medial derecha de forma contundente con dos aplicadores puntiagudos con punta de algodón. En un ratón, esto se hace eviscerando todo el intestino a la izquierda del abdomen, lo que permitirá una visión clara de la VCI (véase la figura 6A).
4. Limpie la grasa que recubre la VCI sin rodeos con aplicadores con punta de algodón.
5. Inyectar la solución de anticuerpos en la VCI mediante venopunción (véase la figura 6B). Tras la extracción de la aguja, aplique inmediatamente una presión suave con un bastoncillo de algodón en el sitio de la venopunción hasta que quede hemostática (generalmente alrededor de 2-3 minutos).
6. Regrese el intestino eviscerado al abdomen sobre el hisopo de algodón para continuar aplicando presión sobre la VCI (véase la figura 6C).
7. Realice la toracotomía en forma de concha de acuerdo con los pasos 5.5-5.7 para extraer el pulmón izquierdo. Permita que los anticuerpos tengan al menos 5 minutos para circular sistémicamente antes del sacrificio y la cosecha. Sacrificar al ratón después de la recolección de ABG y/o el tratamiento con anticuerpos.

7. Tinción histológica (H&E)

1. Después de la fijación en formol y la inclusión en parafina del pulmón izquierdo y la sección hasta un espesor de 5 μm, desparafinar el portaobjetos en xileno (dos lavados de 10 minutos).
2. Deshidratar en lavados secuenciales con etanol: 2 lavados de 5 minutos con 100%, 1 lavado de 2 minutos con 95% y 1 lavado de 2 minutos con etanol al 70%. Luego, enjuague con agua desionizada.
3. Tiñe el portaobjetos con hematoxilina durante 2-4 minutos, luego lávalo con agua desionizada durante 5 minutos o hasta que salga limpio. La duración precisa de la tinción con hematoxilina deberá optimizarse según el tejido y la intensidad de tinción nuclear deseada.
4. Lavar en solución definitoria durante 30 s para diferenciar las manchas, luego lavar con agua durante 2 min. Lavar en solución formadora de color azul durante 30 s, luego lavar en agua durante 2 min.
5. Deshidrate aún más sumergiendo en etanol al 95% 15x. Teñir en eosina durante 1 min.
6. Deshidratar con 2 minutos de lavado con etanol (2x), seguido de 2 min de lavados con xileno (2x). Aplique los medios de montaje y el cubreobjetos.

Resultados

Después del pinzamiento hiliar izquierdo, la presión parcial de oxigenación en la sangre arterial (PaO₂) atribuida al pulmón izquierdo es de ~100 mmHg, significativamente menor en comparación con los ~500 mmHg después de la toracotomía simulada (Figura 7A, n = 6-7). Cabe destacar que se realizaron toracotomías simuladas en ratones B6 con medición de la GAB tomada después de 4 min de pinzamiento hiliar derecho, lo que representa valores atribuidos solo al pulmón izquierd...

Discusión

Describimos una técnica de pinzamiento hiliar que consiste en la aplicación de un nudo corredizo en el hilio izquierdo que ocluye la arteria pulmonar y las venas y bronquios para inducir isquemia caliente seguida de reperfusión. Después del pinzamiento hiliar, se puede extraer el pulmón izquierdo para una variedad de técnicas experimentales como histología, citometría de flujo, secuenciación masiva o de una sola célula y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Además, la sangre y el bazo pueden util...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection