Modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión

Resumen

El protocolo describe un método factible, fiable y reproducible de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo que puede utilizarse para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión pulmonar en modelos de ratón.

Resumen

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) durante el trasplante de pulmón es un factor de riesgo importante para las complicaciones posteriores al trasplante, incluida la disfunción primaria del injerto, el rechazo agudo y crónico y la mortalidad. Los esfuerzos para estudiar los fundamentos de la IRI condujeron al desarrollo de un modelo de ratón fiable y reproducible de pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo. Este modelo consiste en un procedimiento quirúrgico realizado en un ratón anestesiado e intubado. Se realiza una toracotomía izquierda, seguida de una movilización pulmonar cuidadosa y disección del hilio pulmonar izquierdo. La pinza hiliar implica la ligadura reversible del hilio pulmonar con un nudo corredizo, que detiene la entrada arterial, la salida venosa y el flujo de aire a través del bronquio principal izquierdo. La reperfusión se inicia mediante la extracción cuidadosa de la sutura. Nuestro laboratorio utiliza 30 min de isquemia y 1 h de reperfusión para el modelo experimental en las investigaciones actuales. Sin embargo, estos períodos de tiempo pueden modificarse dependiendo de la pregunta experimental específica. Inmediatamente antes del sacrificio, se puede obtener gasometría arterial del ventrículo izquierdo después de un período de 4 minutos de pinzamiento del hilar derecho para garantizar que los valores de_PaO2 obtenidos se atribuyan solo al pulmón izquierdo lesionado. También describimos un método para medir la extravasación celular con citometría de flujo, que implica la inyección intravenosa de un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para la(s) célula(s) que se va a estudiar antes del sacrificio. A continuación, se puede extraer el pulmón izquierdo para la citometría de flujo, congelado o fijo, inmunohistoquímica incluida en parafina y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Esta técnica de pinzamiento hiliar permite un estudio detallado de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la IRI. Los resultados representativos revelan una disminución de la oxigenación del pulmón izquierdo y evidencia histológica de lesión pulmonar después del pinzamiento hiliare. Esta técnica puede ser fácilmente aprendida y reproducida por personal con y sin experiencia microquirúrgica, lo que conduce a resultados confiables y consistentes y sirve como un modelo ampliamente adoptable para el estudio de la IRI pulmonar.

Introducción

La IRI durante el trasplante de órganos es un factor de riesgo importante para la disfunción primaria del injerto y los episodios posteriores de rechazo del injerto ^1,2. Durante el trasplante, el tiempo de isquemia caliente se define como el período de tiempo que transcurre desde el pinzamiento cruzado de la aorta del donante hasta el inicio de la perfusión fría y desde la extracción del órgano desde el hielo hasta la implantación del órgano. El tiempo de almacenamiento en frío se define como el período de tiempo que transcurre desde el inicio de la perfusión en frío hasta la extracción del órgano del hielo

Protocolo

Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Los animales recibieron cuidados humanitarios de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio,^8ª edición²¹ preparada por la Academia Nacional de Ciencias y publicada por los Institutos Nacionales de Salud, y los Principios de cuidado de animales de laboratorio formulados por la Sociedad Nacional de Investigación Médica.

1. Anestesia e intubación

1. Seleccione un ratón que pese al menos 25 g. Esto facilitará l....

Discusión

Describimos una técnica de pinzamiento hiliar que consiste en la aplicación de un nudo corredizo en el hilio izquierdo que ocluye la arteria pulmonar y las venas y bronquios para inducir isquemia caliente seguida de reperfusión. Después del pinzamiento hiliar, se puede extraer el pulmón izquierdo para una variedad de técnicas experimentales como histología, citometría de flujo, secuenciación masiva o de una sola célula y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Además, la sangre y el bazo pueden util.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection