Murine Left Pulmonary Hilar Clamp 폐 허혈 재관류 손상 모델

요약

이 프로토콜은 마우스 모델에서 폐 허혈 재관류 손상을 연구하는 데 사용할 수 있는 실현 가능하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 좌폐 고막 클램핑 방법을 설명합니다.

초록

폐 이식 중 허혈 재관류 손상(IRI)은 원발성 이식편 기능 장애, 급성 및 만성 거부 반응, 사망률을 포함한 이식 후 합병증의 주요 위험 요소입니다. IRI의 토대를 연구하기 위한 노력은 좌측 폐 힐라 클램핑의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 마우스 모델의 개발로 이어졌습니다. 이 모델은 마취되고 삽관된 마우스에서 수행된 수술 절차를 포함합니다. 좌측 흉곽 절개술을 시행한 후 조심스럽게 폐를 움직이고 좌측 폐 하골을 절제합니다. hilar clamp는 슬립매듭으로 폐 hilum의 가역적 봉합 결찰을 포함하여 동맥 유입, 정맥 유출 및 좌측 주줄기 기관지를 통한 공기 흐름을 차단합니다. 재관류는 봉합사를 조심스럽게 제거함으로써 시작됩니다. 우리 실험실은 현재 연구에서 실험 모델에 대해 30분의 허혈과 1시간의 재관류를 사용합니다. 그러나 이러한 기간은 특정 실험 질문에 따라 수정될 수 있습니다. 희생 직전, 4분 동안 오른쪽 힐라 클램핑을 한 후 좌심실에서 동맥혈 가스를 얻을 수 있어 얻은 PaO₂ 값이 손상된 왼쪽 폐에만 기인하는지 확인할 수 있습니다. 또한 유세포 분석을 통해 세포 유출을 측정하는 방법에 대해서도 설명하는데, 이는 희생 전에 연구할 세포에 특이적인 형광 색소 표지 항체의 정맥 주사를 포함합니다. 그런 다음 유세포 분석, 동결 또는 고정, 파라핀 포매 면역조직화학, 정량적 중합효소 연쇄 반응을 위해 왼쪽 폐를 채취할 수 있습니다. 이 힐라 클램프 기술을 사용하면 IRI의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 자세히 연구할 수 있습니다. 대표적인 결과는 좌측 폐 산소 공급이 감소하고 힐라 클램핑 후 폐 손상의 조직학적 증거를 보여줍니다. 이 기법은 미세수술 경험이 있든 없든 누구나 쉽게 배우고 재현할 수 있어 신뢰할 수 있고 일관된 결과를 얻을 수 있으며 폐 IRI를 연구하기 위해 널리 채택할 수 있는 모델 역할을 합니다.

서문

장기 이식 중 IRI는 원발성 이식편 기능 장애 및 이후 이식편 거부 반응의 주요 위험 요인입니다 ^1,2. 이식 중 온열 허혈 시간은 기증자 대동맥 교차 클램프에서 냉간 관류 시작까지의 기간과 얼음에서 장기 제거에서 장기 이식까지의 기간으로 정의됩니다. 냉장 보관 시간은 냉간 관류가 시작된 시점부터 얼음에서 장기를 제거할 때까지의 기간으로 정의된다³. 온난허혈은 한랭허혈보다 후기 장기 기능에 더 해롭다 ^4,5,6, 그리고 그 기저에 깔린 메커니즘은 전임상 모델에서 추가 연구를 필요로 한다. 또한, 심장사 후 기증을 통한 장기 이식(DCD)은 뇌사(DBD) 후 전통적인 기증보다 따뜻한 허혈 시간이 더 긴 것과 관련이 있습니다(⁷). DCD 기증자의 사용은 기증자 풀을 확장하고 폐 이용률을 높일 수 있지만, 이식 후 폐 기능에 대한 온열 허혈의 영향을 평가하기 위한 추가 전임상 연구가 필요합니다. 아래에서는 왼쪽 폐 hilar 클램프를 통한 ....

프로토콜

모든 연구는 Washington University School of Medicine의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 동물은 미국 국립과학원(National Academy of Sciences)이 준비하고 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the care and use of laboratory animals), 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한^{8판 21} 호(Guide for the care and use of laboratory animals), 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험동물 관리 원칙(Principles of laboratory animal care)에 따라 인도적 보호를 받았습니다.

1. 마취 및 삽관

1. 무게가 25g 이상인 마우스를 선택하십시오. 이렇게 하면 성대 사이의 더 큰 구멍으로 인해 삽관이 더 쉬워집니다.
2. 케타민(체중의 선량 100mg/kg)과....

토론

우리는 폐동맥과 정맥 및 기관지를 폐색하는 왼쪽 힐럼에 슬립매듭을 적용하여 온열 허혈을 유도한 후 재관류를 수행하는 hilar clamp 기술에 대해 설명합니다. hilar 클램핑 후 왼쪽 폐를 채취하여 조직학, 유세포 분석, 벌크 또는 단일 세포 시퀀싱, 정량적 중합효소 연쇄 반응과 같은 다양한 실험 기법을 사용할 수 있습니다. 또한 혈액과 비장은 전신 효과를 연구하는 데 사용할 수 있으며 비허혈성 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection