マウス左肺ヒラークランプモデル 肺虚血再灌流損傷

要約

このプロトコルは、マウスモデルにおける肺虚血再灌流障害の研究に使用できる、実現可能で信頼性が高く、再現性のある左肺門結灌法の概要を示しています。

要約

肺移植中の虚血再灌流障害(IRI)は、移植後合併症の主要な危険因子です。これには、原発性移植片の機能障害、急性および慢性の拒絶反応、および死亡率が含まれます。IRIの基盤を研究する努力は、左肺肺門クランプの信頼性と再現性のあるマウスモデルの開発につながりました。このモデルには、麻酔をかけられ挿管されたマウスで行われる外科的処置が含まれます。左開胸術が行われ、続いて慎重な肺動員と左肺肺門の解剖が行われます。肺門クランプは、スリップノットによる肺門の可逆的な縫合結紮を含み、動脈の流入、静脈の流出、および左主幹気管支を通る空気の流れを止めます。再灌流は、縫合糸を慎重に除去することによって開始されます。当研究室では、現在の研究において、実験モデルに30分間の虚血と1時間の再灌流を用いています。ただし、これらの期間は、特定の実験問題に応じて変更できます。犠牲の直前に、右肺門クランプの4分間後に左心室から動脈血ガスを採取して、得られたPaO₂ 値が負傷した左肺のみに起因することを確認できます。また、フローサイトメトリーを使用して細胞外漏出を測定する方法についても説明します。これには、犠牲になる前に研究対象の細胞に特異的な蛍光色素標識抗体の静脈内注射が含まれます。その後、左肺を採取して、フローサイトメトリー、凍結または固定、パラフィン包埋免疫組織化学、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行うことができます。この肺門クランプ技術により、IRIの根底にある細胞および分子メカニズムの詳細な研究が可能になります。代表的な結果は、肺門クランプ後の左肺の酸素化の減少と肺損傷の組織学的証拠を明らかにしています。この技術は、顕微手術の経験の有無にかかわらず、担当者が容易に習得および再現できるため、信頼性が高く一貫した結果が得られ、肺 IRI の研究に広く採用されているモデルとして機能します。

概要

臓器移植中のIRIは、原発性移植片機能障害およびその後の移植片拒絶反応のエピソードの主要な危険因子である^1,2。移植中、温虚血時間は、ドナーの大動脈クロスクランプから冷灌流の開始までの期間、および氷からの臓器摘出から臓器移植までの期間として定義されます。冷蔵保存時間は、冷灌流の開始から臓器の氷からの除去までの期間として定義されます³。温性虚血は、冷性虚血^4,5,6よりも後の臓器機能にとってより有害であり、その根底にあるメカニズムは、前臨床モデルでのさらなる研究を必要とします。さらに、心臓死後の臓器提供(DCD)による臓器移植は、従来の脳死後(DBD)の提供よりも温存性虚血期間が長くなります⁷。DCDドナーの使用はドナープールを拡大し、肺の利用を増やすことができますが、移植後の肺機能に対する温虚血の影響を評価するためのさらなる前臨床研究が必要です。以下では、左肺門クランプを介したマウスの温性IRIのモデルについて説明します。

肺肺門クランプのいくつかの動物モデルが過去数年間に開発され....

プロトコル

すべての研究は、ワシントン大学医学部の動物管理・使用委員会によって承認された。動物は、全米科学アカデミーが作成し、国立衛生研究所が発行した「実験動物の世話と使用に関するガイド」第8^版 第²¹ 号、および全米医学研究会が策定した「実験動物ケアの原則」に従って人道的なケアを受けました。

1.麻酔と挿管

1. 重量が25g以上のマウスを選択します。これにより、声帯間の開口部が大きいため、挿管が容易になります。
2. ケタミン(用量100 mg / kg体重)とキシラジン(用量10 mg / kg体重)の混合物をマウス腹腔内注射します。.この混合物は、1/2インチの29G針で1/2ccシリンジにロードする必要があります。ケタミンが効くまで約5分待ちます - マウスは自発的な動きを示さず、つま先のつま先をつまむことに反応しないため、適切な麻酔が確認されます。
3. 追加の痛み管理のために、手術前にブプレノルフィン(用量0.05 mg / kg体重)を皮下に注射します。.
4. 手術中の角膜の乾燥を避けるために、非薬用眼科用軟膏を両目に塗布します。.
5. 左胸と背中にクリッパーでマウスを剃り( 図1Aを参照)、開腹術が計画されている場合は腹部まで伸ばします....

ディスカッション

肺動脈と静脈、気管支を閉塞して温かい虚血を誘発し、その後再灌流する左の肺門にスリップノットを適用する肺門クランプ技術について説明します。肺門クランプ後、左肺を採取して、組織学、フローサイトメトリー、バルクまたはシングルセルシーケンシング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応などのさまざまな実験技術を行うことができます。さらに、血液と脾臓は全身の影響を研究する?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection