מודל מהדק הילארי ריאתי שמאלי של פגיעה באיסכמיה ריאתית

Summary

הפרוטוקול מתווה שיטה ישימה, אמינה וניתנת לשחזור של הידוק הילארי ריאתי שמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לחקור פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה ריאתית במודלים של עכברים.

Abstract

פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה (IRI) במהלך השתלת ריאות היא גורם סיכון עיקרי לסיבוכים לאחר ההשתלה, כולל תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה חריפה וכרונית ותמותה. מאמצים לחקור את היסודות של IRI הובילו לפיתוח מודל עכבר אמין וניתן לשחזור של הידוק הילאר ריאה שמאלית. מודל זה כולל הליך כירורגי המבוצע בעכבר מורדם ואינטובציה. מבוצעת כריתת בית חזה שמאלי, ואחריה גיוס ריאות זהיר ודיסקציה של הילום הריאה השמאלי. המהדק ההילארי כרוך בקשירת תפר הפיכה של הילום הריאתי עם חלקלק, אשר עוצר את זרימת העורקים, זרימת ורידים וזרימת אוויר דרך הסימפונות הראשיים השמאליים. זילוח הוא יזם על ידי הסרה זהירה של התפר. המעבדה שלנו משתמשת 30 דקות של איסכמיה ו 1 שעה של זילוח עבור המודל הניסויי בחקירות הנוכחיות. עם זאת, פרקי זמן אלה ניתנים לשינוי בהתאם לשאלת הניסוי הספציפית. מיד לפני ההקרבה, ניתן לקבל גז דם עורקי מהחדר השמאלי לאחר פרק זמן של 4 דקות של הידוק הילאר ימני כדי להבטיח שערכי PaO₂ המתקבלים מיוחסים לריאה השמאלית הפגועה בלבד. אנו מתארים גם שיטה למדידת אקסטרווסציה של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה, הכוללת הזרקה תוך ורידית של נוגדן עם תווית פלואורוכרום ספציפי לתא(ים) שיש לחקור לפני הקרבה. לאחר מכן ניתן לקצור את הריאה השמאלית לצורך ציטומטריית זרימה, קפוא או קבוע, אימונוהיסטוכימיה משובצת פרפין ותגובת שרשרת כמותית של פולימראז. טכניקת הידוק הילארי זו מאפשרת מחקר מפורט של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס IRI. תוצאות מייצגות חושפות ירידה בחמצון הריאה השמאלית ועדות היסטולוגית לפגיעה ריאתית בעקבות הידוק הילארי. טכניקה זו ניתנת ללמידה ולשכפול בקלות על ידי אנשי צוות עם וללא ניסיון מיקרוכירורגי, מה שמוביל לתוצאות אמינות ועקביות ומשמש כמודל הניתן לאימוץ נרחב לחקר IRI ריאות.

Introduction

IRI במהלך השתלת איברים הוא גורם סיכון עיקרי לתפקוד לקוי ראשוני של השתל ולאפיזודות מאוחרות יותר של דחיית השתל ^1,2. במהלך ההשתלה, זמן איסכמיה חמה מוגדר כפרק הזמן שבין הידוק צולב אבי העורקים של התורם להתחלת זילוח קר ומהסרת איברים מקרח להשתלת איברים. זמן אחסון קר מוגדר כפרק הזמן מתחילת הזלוף הקר ועד להוצאת האיבר מקרח³. איסכמיה חמה מזיקה יותר לתפקוד איברים מאוחר יותר מאשר איסכמיה קרה ^4,5,6, והמנגנונים הבסיסיים שלה מצדיקים מחקר נוסף במודלים פרה-קליניים. בנוסף, השתלת איברים מתרומה לאחר מוות לבבי (DCD) קשורה לזמנים איסכמיים חמים ארוכים יותר מאשר תרומה מסורתית לאחר מוות מוחי (DBD)⁷. בעוד שהשימוש בתורמי DCD יכול להרחיב את מאגר התורמים ולהגדיל את ניצול הריאות, נדרשים מחקרים פרה-קליניים נוספים להערכת ההשפעות של איסכמיה חמה על תפקוד הריאות לאחר ההשתלה. להלן נתאר מודל של IRI חם בעכברים דרך מהדק הילאר ריאתי שמאלי.

מספר מודלים בבעלי חיים של הידוק הילאר ריאות פותחו והותאמו במהלך השנים האחרונות ועשויים לכלול שימוש במהדק מיקרו-וסקולרי א-טראומטי 8,9,10,11,12,13, חוסם עורקים רומל ^14,15 או קשירת תפרים¹⁶ כמו מהדק hilar. עיקר המהדק ההילארי הוא שהוא חייב להיות הפיך ולגרום נזק מינימלי או ללא נזק למבנים ההילאריים, כך שניתן יהיה להשיג זילוף. כאן, אנו מתארים את טכניקת המהדק ההילארי שלנו בעכברים הכוללת קשירת תפר הפיכה של הילום ריאתי שמאלי עם חלקלק. שיטה זו חוסמת את זרימת עורקי הריאה, את הזרימה הוורידית ואת זרימת האוויר פנימה והחוצה מהסימפונות הראשיים. היתרון העיקרי של החלקה על מהדק כלי דם, קליפס או חוסם עורקים הוא שניתן לסגור את החזה בתקופות ממושכות של איסכמיה, ובכך למזער איבוד נוזלים וחום בלתי נתפס בעכבר. אנו מספקים פרוטוקול להשגת מדידות אמינות של גז דם עורקי (ABG) ולמדידת אקסטרווציה של תאים לאחר הידוק הילארי.

טכניקת הידוק הילארי זו תופסת מקום חשוב במחקר הרחב יותר של השתלת ריאות. בהשוואה למודלים של בעלי חיים קטנים של השתלת ריאות אורתוטופית, טכניקת ההידוק ההילארי יכולה לבודד את ההשפעות של IRI ללא תוספת של טראומה אנסטומוטית כירורגית או אלוגניות¹⁷. בנוסף, ניתן לשלוט בקלות ובמהירות רבה יותר בטכניקת ההידוק הילאר מאשר השתלת ריאות עכבר. למעשה, באמצעות טכניקות מהדק hilar, מספר מנגנונים חשובים בפתוגנזה של IRI זוהו בעשור האחרון, כגון TLR4, NADPH oxidase, וקולטן אדנוזין A2A 14,18,19,20. בפרוטוקול הבא, אנו מציגים שיטה אמינה, ניתנת ללימוד וניתנת לשחזור של הידוק hilar ככלי לחקר IRI ריאות.

Protocol

כל המחקרים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. בעלי חיים קיבלו טיפול הומני בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה 8²¹ שהוכן על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, ועקרונות הטיפול בחיות מעבדה שגובשו על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי.

1. הרדמה ואינטובציה

1. בחר עכבר ששוקל לפחות 25 גרם. זה יקל על אינטובציה בשל הפתח הגדול יותר בין מיתרי הקול.
2. הזריקו לעכבר תערובת של קטמין (מינון של 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (מינון של 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף). תערובת זו צריכה להיות טעונה לתוך מזרק 1/2 סמ"ק עם מחט 1/2 אינץ '29G. המתינו כ-5 דקות עד שהקטמין ייכנס לתוקף - העכבר לא אמור להפגין תנועה ספונטנית ואינו מגיב לצביטה בבוהן, המאשרת הרדמה נאותה.
3. יש להזריק בופרנורפין (מינון של 0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תת עורית לפני הניתוח לשליטה נוספת בכאב.
4. החל משחה אופתלמית לא תרופתית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך הניתוח.
5. גלחו את העכבר עם קוצץ מעל החזה השמאלי והגב (ראו איור 1A), המשתרע על הבטן אם מתוכננת לפרטומיה (ראו שלב 5.3).
6. לאחר שהעכבר מורדם, בצע את האינטובציה באמצעות מערך אינטובציה מועדף ואת שאר ההליך תחת מיקרוסקופ מעל שטיחון מחומם ב~ 37 מעלות צלזיוס (כדי לשמור על נורמותרמיה בעכבר).
7. לאחר השגת תצוגה נאותה של מיתרי הקול, הכניסו מבוא תוצרת בית (ראו איור משלים 1) עם קימור בקצה לתוך אנגיוקטטר 20G בגודל 1 אינץ', המשמש כצינור האנדוטרכאלי (ETT). הנחו את קצה המבוא ולאחר מכן את ה-ETT בין מיתרי הקול ועברו אותם.
   הערה: חשוב לדמיין את ETT עובר דרך מיתרי הקול כדי למנוע אינטובציה מזויפת לתוך הוושט. יש להקפיד להימנע מפגיעה במיתרי הקול במהלך האינטובציה (כלומר, מספר ניסיונות האינטובציה צריך להיות מוגבל ל-5 ואין לקדם את ה-ETT אם מתקיימת התנגדות).
8. לאחר הכנסת ה-ETT, הסר את המבוא וחבר את ה-ETT למכונת הנשמה של בעלי חיים קטנים. שימו לב לעלייה סימטרית בחזה כדי לאשר אינטובציה אנדוטרכאלית נכונה. הגדרות ההנשמה צריכות להיות 100-105 נשימות לדקה ושבריר חמצן השראה של 100%. נפח הגאות הוא 0.35 מ"ל ולחץ הפקיעה הסופי החיובי הוא 1 ס"מ H₂O.
   הערה: ודא כי החזה ולא הבטן עולה כמו אינטובציה בשוגג הוושט יוביל למוות אם לא לתקן מיד.
9. לאחר שאושר שהוא נמצא במקומו, אבטח את ה-ETT באמצעות רצועה של 5 ס"מ של סרט משי בגודל 1 אינץ' סביב אף העכבר, כדי להבטיח מגע הולם עם ה-ETT והאף כך שה-ETT לא יחליק החוצה מהפה (ראה איור 1B-C).
10. כדי לשמור על הרדמה מספקת לאורך כל הניתוח, יש לתת איזופלורן 1%-1.5% בקו אחד עם זרימת החמצן.

2. Thoracotomy

1. מקמו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צידית ימנית, כאשר שתי הכפות הקדמיות מודבקות לפינה השמאלית העליונה, הכף האחורית הימנית מודבקת לפינה השמאלית התחתונה, והכף האחורית השמאלית מודבקת לפינה הימנית התחתונה (ראו איור 2G להקשה).
2. יש לחטא עם העור מעל החזה השמאלי עם לפחות 3 סבבים לסירוגין של יוד פובידון ואחריו מריחת 70% אלכוהול.
3. בצעו חתך מעל החלל הבין-קוסטלי^ה-4 מקו בית השחי הקדמי לקו בית השחי האחורי, באמצעות מספריים כדי לפתוח את העור שמעליו (ראו איור 2A). החלל הבין-קוסטלי^הרביעי ממוקם כ-1 ס"מ מתחת לבית השחי בקו אמצע בית השחי.
4. כדי למזער את איבוד הדם, קריש כלי דם גלויים בתוך השכבות התת עוריות והשריריות באמצעות עט צריבה ידני.
5. חלקו את השרירים הקדמיים latissimus dorsi ו-serratus בחדות באמצעות מספריים לאורך חתך העור (ראו איור 2B).
6. בעזרת מלקחיים מעוקלים עדינים, הרימו בזהירות את הצלע^ה-4 (תוך זהירות שלא לפגוע בריאה שמתחתיה) ובצעו חיתוך נקודתי עם מספריים עדינים ממש מעל הצלע^ה-5 כדי להיכנס לחלל הבין-קוסטלי^ה-4 (ראו איור 2C). בצע את בית החזה מעל הצלע ה^- 5 ולא^{מתחת לצלע} ה -4 כדי למנוע פגיעה בצרור הנוירו-וסקולרי הבין-קוסטלי.
7. ברגע שהלחץ על חלל הפלאורל השלילי אובד והריאה נסוגה מדופן בית החזה, הרחיבו את בית החזה קדימה ואחורה בחלל הבין-קוסטלי^ה-4 ממש מעל הצלע^ה-5 (ראו איור 2D-E). אורך החתך כולו צריך להיות ארוך מספיק כדי לחשוף את הריאה כולה, בדרך כלל ~ 1 ס"מ.
   הערה: דימום בעורק החלב הפנימי יכול להתרחש אם בית החזה מורחב רחוק מדי קדמית - אם נתקלים, זה צריך להיות צרוב כדי למנוע איבוד דם מוגזם.
8. יש למרוח שני מחזירי צלעות כדי לפתוח את חלל הצלעות, ולאפשר חלון עבודה של לפחות 1 ס"מ² להדמיה נאותה (ראו איור 2F-G).

3. יישום של מהדק hilar

1. בעזרת אפליקטורים בעלי שתי נקודות כותנה, גייסו את הריאה השמאלית על-ידי הגבהתה ולאחר מכן חלוקה בוטה של הרצועה הריאה התחתונה השקופה (ראו איור 3A-B).
   הערה: אם זה מאתגר לבצע מבלי לקרוע את הריאה, הרצועה הריאה התחתונה ניתן גם לחלק בחדות באמצעות מספריים עדינים.
2. לשקף את הריאה הקדמית, כך הילום ריאתי שמאלי אחורי ניתן לדמיין. חתכו פיסת עניבת משי 6-0 ל~10 ס"מ והניחו את נקודת האמצע של עניבה זו אחורית להילום (ראו איור 3C).
3. לאחר מכן, הפכו את הריאה השמאלית לאחור כדי לשכב מעל העניבה ומשכו את שני קצוות העניבה קדימה (ראו איור 3D).
4. עם שני הקצוות החופשיים (A ו-B) של העניבה, קשר-מכשיר מחליק הפיך עם מלקחיים ומהדק יתושים מעוקל. ראה תיאור מפורט בשלבים 3.4.1 ו- 3.4.2. הזמן האיסכמי החם מתחיל עם קשירת החלקה. הריאה השמאלית כבר לא אמורה להתנפח עם כל נשימה של מכונת הנשמה ברגע שהקשר קשור. זה צריך להיות לבן חיוור מרמז על הפסקת זילוח.
   הערה: יש להקפיד לוודא שהקשר יושב באמצע ההילום, ולהימנע מלחרור בשוגג של האטריום השמאלי במרכז ושל פרנכימת הריאה לרוחב (ראו איור 3F).
   1. עם מהדק ביד הדומיננטית ומלקחיים ביד הלא דומיננטית, החזיקו את קצה A עם מלקחיים וסובבו את נקודת האמצע של A סביב המהדק הסגור פעם אחת (ראו איור 3E).
   2. אחוז את נקודת האמצע של B עם המהדק ומשוך בשתי הידיים כדי לצבוט את החלקה. אל תתנו לקצה של B למשוך את הקשר, מה שיהפוך את הקשר לבלתי הפיך. לאחר קשירת הקשר, B צריכה להיות לולאה שיוצאת מהקשר, בעוד A צריכה להיות ישרה (ראו איור 3F). הקשר יכול להשתחרר על ידי משיכת הקצה של B.
5. אשרו חסימה נאותה של הסימפונות על-ידי חסימה ידנית של צינור הזרימה מה-ETT למכונת ההנשמה, מה שאמור לגרום לריאה השמאלית לא להתנפח (ראו איור 3G). חסימת כלי דם מניחה עם חסימת הסימפונות בהתחשב בקריסה מוגברת של עורק הריאה והוורידים בהשוואה לסימפונות הסחוסיים.
6. לאחר יישום המהדק ההילארי, סגור את חתך העור בתפר אחד פשוט וקטוע באמצעות תפר ניילון 6-0, כדי למזער הפסדי נוזלים בלתי מורגשים במהלך תקופת איסכמיה חמה.

4. שחרור מהדק hilar

1. לאחר התקופה הרצויה של איסכמיה חמה, שחררו את החלקה על-ידי משיכה עדינה בקצה החופשי הקצר של עניבת המשי (B מאיור 3F ושלב 3.4). התחל את זמן הרפרפוזיה עם שחרור החלקה.
   הערה: לאחר שחרור העניבה, אוורור הריאות יכול להיות מאושר על ידי חסימה ידנית שוב של זרימת ETT, אשר אמור כעת לגרום להרחבה של הריאה השמאלית. שוב, זילוח נרמז עם ניפוח של הריאה, אולם הוא יכול להיות מאושר גם על-ידי כך שהריאה מתכווצת כלפי מעלה (ראו איור 4A).
2. במהלך תקופת הרפרפוזיה, סגור את החזה בשלוש שכבות כדי למזער הפסדים בלתי מורגשים. ראשית, סגרו את חלל הצלעות^ה-4 בתפר יחיד עם תפר ניילון 6-0, עם נגיסה אחת ממש^{מעל הצלע} הרביעית ונשיכה אחת ממש^{מעל הצלע} ה-6 (ראו איור 4B-C). קשרו זאת לניפוח ריאות מקסימלי, כדי למזער את הסיכון לדלקת ריאות יאטרוגנית (ראו איור 4D-E).
3. לאחר מכן, סגרו את שכבת השריר באמצעות תפר ריצה פשוט עם תפר ניילון 6-0.
4. לבסוף, סגרו את חתך העור בתפר פשוט וקטוע עם תפר ניילון 6-0 (ראו איור 4F). הימנעו מביצוע תפרים על העור בשל הסיכון שבעלי חיים ערים יקטפו את החתך שלהם ויובילו לפגיעה מוחלטת בפצע.
5. מנקודה זו, ניתן לקצור את הריאה ישירות בתום זמן הזילוח הרצוי. אם הערכת ABG רצויה, ראה שלב 5. אם יש צורך בהזרקה תוך ורידית נוספת לפני ההקרבה, ראה שלב 6. זהו ניתוח סופני.
6. אם זמן הרפרפוזיה מיועד להיות גדול מכמה שעות, כבו את האיזופלורן כדי לאפשר לעכבר להתעורר מהרדמה ולהוציא החוצה. קריטריוני אקסטובציה כוללים עוויתות עם צביטת כפות ונשימות ותנועה ספונטניות. התעוררות עכבר מהרדמת קטמין ואיזופלורן אורכת בדרך כלל 30-45 דקות. זהו ניתוח הישרדות.
   1. לניתוח הישרדות, יש להזריק 1 מ"ל של מי מלח חמים באופן תת-עורי כדי להסביר את אובדן הנוזלים מהניתוח. יש להזריק בופרנורפין (מינון 0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תת עורית לפני ניתוח לשליטה בכאב. יש לחזור על ההרדמה כל 4-6 שעות במשך 3 ימים לפחות לאחר הניתוח. שקול בלוק bupivacaine לאורך החתך עבור שליטה נוספת בכאב.

5. הערכת ABG

הערה: אם רוצים למדוד ABG, זה מתקבל בצורה הטובה ביותר באמצעות שאיפת דם עורקית מהחדר השמאלי. כדי לוודא כי ABG משקף רק את תפקוד הריאה השמאלית, דם עורקי זה צריך להתקבל לאחר כ 4 דקות של הילום ימין להיות מהודק^22,23, שבמהלכו רק הריאה השמאלית מבצעת חמצון ואוורור.

1. אם העכבר התעורר מהרדמה לאחר הידוק הילארי, יש להרדים מחדש ולבצע אינטובציה לעכבר בהתאם לשלב 1.
2. כ 15-20 דקות לפני סוף זמן הזילוח הרצוי, מקם את עמוד השדרה של העכבר, מאבטח את כל ארבעת הגפיים עם נייר דבק.
   הערה: יש להקצות מספיק זמן לביצוע השלבים הבאים לפני סיום הרפרפוזיה. תזמון ספציפי לפתיחת הבטן והחזה ישתנה בהתאם למנתח ולניסיונו.
3. בצעו לפרוטומיה בקו האמצע מעצם הערווה ועד לקסיפואיד, וחתכו במספריים את העור ואחריו את דופן הבטן לאורך הלינאה אלבה (ראו איור 5A-B).
4. בקסיפואיד, מרחיבים את הלפרטומיה ימינה ושמאלה לקו בית השחי הקדמי, בעקבות העקומה של הצלע התחתונה ביותר (ראו איור 5C).
5. מהבטן, חתכו את הסרעפת הקדמית בקו האמצע כדי להיכנס לחזה, והיזהרו לא להיכנס עמוק מדי כדי להימנע מפגיעה בלב (ראו איור 5D-E). לאחר מכן, הרחיבו את החתך הקדמי בסרעפת שמאלה וימינה לקו בית השחי הקדמי, לאורך הצלע התחתונה ביותר (ראו קו לבן מקווקו באיור 5D).
6. חלקו את הצלעות הדו-צדדיות לאורך קו בית השחי הקדמי, הנמשך כלפי מעלה לכיוון בית השחי, כדי ליצור בית חזה צדפה. לאחר מכן, שיקפו את דופן בית החזה הקדמי (עצם החזה והצלעות הקדמיות הדו-צדדיות), מה שמאפשר חשיפה מלאה של הלב והריאות הדו-צדדיות (ראו קווים לבנים מנוקדים באיור 5F).
7. יש למרוח מהדק על דופן החזה הקדמית ההפוכה כדי להקל על הנסיגה. משכו את הסרעפת כלפי מטה בעזרת מהדק יתושים מעוקל בקו האמצע כדי לשפר את ההדמיה של החזה (ראו איור 5F).
8. כדי לנייד באופן מלא את הריאה הימנית (שיש לה 4 אונות), החזירו את האונה האביזרית המשתרעת מעבר לקו האמצע אל החזה השמאלי בחזרה אל החזה הימני (ראו איור 5G-H). יש רצועה דקה המחברת את האונה הזו לחזה השמאלי - מחלקים אותה בבוטות עם אפליקטורים עם צמר גפן או בחדות עם מספריים.
   הערה: אונת אביזר זו חוצה את קו האמצע האחורי לווריד הנבוב התחתון (IVC), ולכן יש להיזהר שלא לפגוע ב- IVC במהלך תמרון זה.
9. לאחר שכל האונות מוחזרות לחזה הימני, יש לשקף את כל הריאה הימנית קדימה ולהניח עוד 6-0 עניבת משי (חתוכה ל~10 ס"מ) אחורית להילום הימני. לאחר מכן, החליפו את הריאה הימנית בחזרה לחזה מעל העניבה.
10. קשרו החלקה נוספת סביב הילום הימני באותה טכניקה המתוארת בשלב 3.4, תוך הקפדה להקיף את כל ארבע האונות של הריאה הימנית. שלב מהדק הילארי ימני זה צריך להיות מתוזמן כ -4 דקות לפני סוף הזילוח.
11. מצפים מחט 1/2 אינץ '31G על מזרק שחפת 1 סמ"ק עם כ 200 μL של הפרין 1000 יחידה / מ"ל. כדי לעשות זאת, למשוך את נפח הפרין שוב ושוב למשוך את הבוכנה קדימה ואחורה 3-4 פעמים כדי לאפשר הפרין לצפות את כל החלק הפנימי של המזרק. זה נעשה כדי למזער את הסיכון של דם שואף קרישת במהלך ההובלה מתחנת הניתוח למכונת ABG .
12. לאחר 4 דקות של הידוק הילאר ימני, שאפו דם עורקי מהחדר השמאלי לתוך המזרק המצופה בהפרין (ראו איור 5I). יש להקפיד להימנע מניקוב מחיצת החדר ומשאיפת דם ורידי החדר הימני בשוגג. יש הבדל צבע ברור בין החדר הימני הכהה יותר לחדר השמאלי הבהיר יותר (ראו כניסה לתמונה 5I). זווית המחט לכיוון הצוואר השמאלי. נקבים מרובים עשויים להידרש כדי להשיג מספיק דם כדי להפעיל ABG (~ 150 μL).
    הערה: במהלך 4 הדקות של מהדק הילרי הימני, העכבר עשוי להתחיל להפגין נשימה מייסרת, המבשרת את המוות הממשמש ובא. אם זה קורה, דם עורקי צריך להיות שואף במהירות לפני דום לב. לא ניתן לשאוף דם מלב שאינו פועם.
13. הפעל את הדם העורקי על מכונת ABG כדי להשיג רוויית חמצן, לחץ חלקי של חמצן, לחץ חלקי של פחמן דו חמצני, בין מדידות אחרות. יש להרדים את העכבר לאחר איסוף ABG ו/או טיפול בנוגדנים (ראה שלב 6).

6. הזרקת נוגדנים תוך ורידית למדידת אקסטרווסציה של תאים

הערה: טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע אקסטרווסציה של תאים באמצעות הזרקה של נוגדנים המסומנים פלואורוכרום תוך ורידי לתוך IVC לפני הקרבה ואחריו ניתוח ציטומטרי זרימה, כפי שפורסם בעבר¹⁸. בקצרה, ניתן להבחין בין נויטרופילים תוך וסקולריים לבין נויטרופילים אינטרסטיציאליים באמצעות נוגדנים ספציפיים לנויטרופילים נגד Ly6G. Fluorescein isothiocyanate-labeled (FITC-labeled) anti-Ly6G (שיבוט 1A8) מוזרק לווריד 5 דקות לפני ההקרבה, אשר מסמן את הנויטרופילים התוך-וסקולריים במחזור. הריכוז של נוגדן FITC-Ly6G בשימוש הוא 100 ng מדולל ב 200 μL של מלוחים חוצצים פוספט. לאחר מכן, לאחר הכנת תרחיף תא בודד מהריאה השמאלית לצורך ציטומטריית זרימה, כל הנויטרופילים מסומנים באלופיקוציאנין (APC-labeled) אנטי-Ly6G (שיבוט 1A8). לפיכך, APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G⁺ נויטרופילים הם תוך-וסקולריים ואילו APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G^- הם חוץ-וסקולריים או אינטרסטיציאליים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת מונוציטים עם נוגדנים anti-Ly6C, תאי B עם נוגדנים anti-CD19, למשל.

1. טען את הנוגדן הרצוי לתוך מזרק 3/10 סמ"ק עם מחט 5/16 אינץ '31G, תוך הקפדה על מזעור בועות האוויר בתוך המזרק. השתמש בו להזרקה תוך ורידית לתוך IVC בשלב 6.5.
2. בצע laparotomy על פי שלבים 5.3-5.4.
3. לאחר הלפרוטומיה, יש לבצע סיבוב ויסצרלי מדיאלי ימני בצורה בוטה באמצעות שני אפליקטורים מחודדים מכותנה. בעכבר, זה נעשה על ידי הסרת כל המעי משמאל לבטן, אשר יאפשר מבט ברור של IVC (ראה איור 6A).
4. נקו את השומן שמעל ה-IVC בבוטות בעזרת אפליקטורים עם צמר גפן.
5. הזריקו את תמיסת הנוגדנים לתוך IVC באמצעות ניקור (ראו איור 6B). עם עקירת המחט, מיד להפעיל לחץ עדין עם צמר גפן על האתר של venipuncture עד שהוא hemostatic (בדרך כלל כ 2-3 דקות).
6. החזירו את המעי הגס לתוך הבטן מעל צמר גפן כדי להמשיך להפעיל לחץ על IVC (ראו איור 6C).
7. בצע צדפה thoracotomy על פי שלבים 5.5-5.7 כדי לקצור את הריאה השמאלית. יש לאפשר לנוגדנים לפחות 5 דקות לזרום באופן מערכתי לפני ההקרבה והקציר. יש להרדים את העכבר לאחר איסוף ABG ו/או טיפול בנוגדנים.

7. צביעת היסטולוגיה (H&E)

1. לאחר קיבוע פורמלין והטמעת פרפין של הריאה השמאלית וחתך לעובי של 5 מיקרומטר, מפרקים את המגלשה בקסילן (שתי שטיפות של 10 דקות).
2. יש לייבש בשטיפות אתנול סדרתיות: שטיפה של 2x 5 דקות עם 100%, שטיפה של 1x 2 דקות עם 95%, ושטיפה של 1x 2 דקות עם 70% אתנול. לאחר מכן, יש לשטוף במים נטולי יונים.
3. הכתימו את המגלשה עם המטוקסילין למשך 2-4 דקות, ולאחר מכן שטפו במים נטולי יונים, במשך 5 דקות או עד שהיא צלולה. משך הזמן המדויק של צביעת המטוקסילין יצטרך להיות מותאם לרקמה ולעוצמת הצביעה הגרעינית הרצויה.
4. יש לשטוף בתמיסה מוגדרת למשך 30 שניות כדי להבדיל בין כתמים, ולאחר מכן לשטוף במים למשך 2 דקות. יש לשטוף בתמיסת יצירת צבע כחול למשך 30 שניות, ולאחר מכן לשטוף במים למשך 2 דקות.
5. יש לייבש עוד יותר על ידי טבילה באתנול 95% פי 15. מכתים באאוזין למשך דקה.
6. יש לייבש עם שטיפות אתנול של 2 דקות (2x), ולאחר מכן שטיפות קסילן של 2 דקות (2x). החל מדיית הרכבה והחלקת כיסוי.

תוצאות

לאחר הידוק הילארי שמאלי, לחץ חלקי של חמצון בדם העורקי (PaO₂) המיוחס לריאה השמאלית הוא ~100 מ"מ כספית, נמוך משמעותית בהשוואה ל~500 מ"מ כספית לאחר כריתת בית חזה דמה (איור 7A, n=6-7). יש לציין כי תראקוטומיות דמה בוצעו בעכברי B6 כאשר מדידת ABG נלקחה לאחר 4 דקות של הידוק הילארי ימני, המייצג...

Discussion

אנו מתארים טכניקת מהדק הילארי הכוללת יישום של slipknot על הילום שמאל אשר חוסם את עורק הריאה וורידים ואת הסימפונות כדי לגרום איסכמיה חמה ואחריו reperfusion. לאחר הידוק הילארי, ניתן לקצור את הריאה השמאלית למגוון טכניקות ניסיוניות כגון היסטולוגיה, ציטומטריית זרימה, ריצוף בתפזורת או בתא בודד, ותגובת ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection