Akciğer İskemisi Reperfüzyon Hasarının Murin Sol Pulmoner Hiler Klemp Modeli

Özet

Protokol, fare modellerinde akciğer iskemi-reperfüzyon hasarını incelemek için kullanılabilecek uygulanabilir, güvenilir ve tekrarlanabilir bir sol pulmoner hiler klempleme yöntemini özetlemektedir.

Özet

Akciğer nakli sırasında iskemi reperfüzyon hasarı (IRI), primer greft disfonksiyonu, akut ve kronik rejeksiyon ve mortalite dahil olmak üzere nakil sonrası komplikasyonlar için majör bir risk faktörüdür. IRI'nin temellerini inceleme çabaları, sol akciğer hiler klemplemesinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir fare modelinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu model, anestezi uygulanmış ve entübe edilmiş bir farede gerçekleştirilen cerrahi bir prosedürü içerir. Sol torakotomi yapılır, ardından dikkatli akciğer mobilizasyonu ve sol pulmoner hilus diseksiyonu yapılır. Hiler klemp, sol ana gövde bronşundan arteriyel girişi, venöz çıkışı ve hava akışını durduran bir kayma ile pulmoner hilusun geri dönüşümlü sütür ligasyonunu içerir. Reperfüzyon, dikişin dikkatli bir şekilde çıkarılmasıyla başlatılır. Laboratuvarımız güncel incelemelerde deneysel model için 30 dk iskemi ve 1 saat reperfüzyon kullanmaktadır. Bununla birlikte, bu zaman dilimleri belirli deneysel soruya bağlı olarak değiştirilebilir. Kurban edilmeden hemen önce, elde edilen PaO₂ değerlerinin sadece yaralı sol akciğere atfedildiğinden emin olmak için 4 dakikalık bir sağ hiler klempleme periyodundan sonra sol ventrikülden arteriyel kan gazı alınabilir. Ayrıca, kurban edilmeden önce incelenecek hücre(ler) için spesifik florokrom etiketli bir antikorun intravenöz enjeksiyonunu içeren akış sitometrisi ile hücre ekstravazasyonunu ölçmek için bir yöntem de tarif ediyoruz. Sol akciğer daha sonra akış sitometrisi, donmuş veya sabitlenmiş, parafine gömülü immünohistokimya ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu için hasat edilebilir. Bu hiler klemp tekniği, IRI'nin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanır. Temsili sonuçlar, sol akciğer oksijenasyonunun azaldığını ve hiler klempleme sonrası akciğer hasarının histolojik kanıtlarını ortaya koymaktadır. Bu teknik, mikrocerrahi deneyimi olan ve olmayan personel tarafından kolayca öğrenilebilir ve çoğaltılabilir, bu da güvenilir ve tutarlı sonuçlara yol açar ve akciğer IRI'sini incelemek için yaygın olarak benimsenen bir model olarak hizmet eder.

Giriş

Organ nakli sırasında IRI, primer greft disfonksiyonu ve daha sonraki greft reddi atakları için önemli bir risk faktörüdür ^1,2. Transplantasyon sırasında sıcak iskemi süresi, donör aort kros klempinden soğuk perfüzyonun başlanmasına ve organın buzdan çıkarılmasından organ implantasyonuna kadar geçen süre olarak tanımlanır. Soğuk hava deposu süresi, soğuk perfüzyonun başlamasından organın buzdan çıkarılmasına kadar geçen süre olarak tanımlanır³. Sıcak iskemi, daha sonraki organ fonksiyonları için soğuk iskemi ^4,5,6'dan daha zararlıdır ve altta yatan mekanizmaları, klinik öncesi modellerde daha fazla çalışmayı gerektirir. Ek olarak, kardiyak ölüm sonrası bağıştan (DCD) organ nakli, beyin ölümünden sonra geleneksel bağıştan (DBD) daha uzun sıcak iskemik sürelerle ^{ilişkilidir7}. DCD donörlerinin kullanımı donör havuzunu genişletebilir ve akciğer kullanımını artırabilirken, sıcak iskeminin nakil sonrası akciğer fonksiyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için daha fazla klinik öncesi çalışmaya ihtiyaç vardır. Aşağıda, farelerde sol pulmoner hiler klemp yoluyla bir sıcak IRI modelini açıklıyoruz.

Son birkaç yılda akciğer hiler klemplemesinin çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiş ve uyarlanmıştır ve atravmatik mikrovasküler klemp 8,9,10,11,12,13, Rumel turnike^14,15 veya sütür ligasyonu¹⁶ kullanımını içerebilir hilar kelepçe olarak. Hiler kelepçenin püf noktası, geri dönüşümlü olması ve reperfüzyonun elde edilebilmesi için hiler yapılarına minimum veya hiç zarar vermemesi gerektiğidir. Burada, farelerde sol pulmoner hilusun bir kayma düğümü ile geri dönüşümlü sütür ligasyonunu içeren hiler klemp tekniğimizi açıklıyoruz. Bu yöntem, pulmoner arteriyel girişi, venöz çıkışı ve ana gövde bronşunun içine ve dışına hava akışını tıkar. Vasküler bir klemp, klips veya turnike üzerindeki bir düğümün ana yararı, uzun süreli iskemi dönemlerinde göğsün kapatılabilmesi ve böylece farede duyarsız sıvı ve ısı kaybını en aza indirgemesidir. Güvenilir arteriyel kan gazı (ABG) ölçümleri elde etmek ve hiler klempleme sonrası hücre ekstravazasyonunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Bu hiler klemp tekniği, akciğer nakli ile ilgili daha geniş bir çalışmada önemli bir yer tutmaktadır. Ortotopik akciğer transplantasyonunun küçük hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, hiler klemp tekniği, cerrahi anastomoz travması veya allojenite eklenmeden IRI'nin etkilerini izole edebilir¹⁷. Ek olarak, hiler klemp tekniği, fare akciğer naklinden daha kolay ve hızlı bir şekilde ustalaşabilir. Aslında, hiler klemp teknikleri kullanılarak, son on yılda IRI patogenezinde TLR4, NADPH oksidaz ve adenozin A2A reseptörü ^14,18,19,20 gibi birkaç önemli mekanizma tanımlanmıştır. Aşağıdaki protokolde, akciğer IRI'yi incelemek için bir araç olarak güvenilir, öğretilebilir ve tekrarlanabilir bir hiler klempleme yöntemi sunuyoruz.

Protokol

Tüm çalışmalar Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar, Ulusal Bilimler Akademisi tarafından hazırlanan ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Kılavuz, 8^{. baskı 21} ve Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği tarafından formüle edilen laboratuvar hayvanı bakımı ilkelerine uygun olarak insancıl bakım aldı.

1. Anestezi ve entübasyon

1. En az 25 g ağırlığında bir fare seçin. Bu, ses telleri arasındaki daha büyük delik nedeniyle daha kolay entübasyonu kolaylaştıracaktır.
2. Fareye intraperitoneal olarak bir ketamin (vücut ağırlığı dozu 100 mg/kg) ve ksilazin (vücut ağırlığı dozu 10 mg/kg doz) karışımı enjekte edin. Bu karışım 1/2 inç 29G iğne ile 1/2 cc'lik bir şırıngaya yüklenmelidir. Ketaminin etkili olması için yaklaşık 5 dakika bekleyin - fare kendiliğinden hareket göstermemeli ve yeterli anesteziyi doğrulayan bir ayak parmağı tutamına yanıt vermemelidir.
3. Ek ağrı kontrolü için ameliyattan önce deri altına buprenorfin (vücut ağırlığının 0.05 mg / kg dozu) enjekte edin.
4. Ameliyat sırasında kornea kurumasını önlemek için her iki gözünüze ilaçsız oftalmik merhem sürün.
5. Fareyi sol göğsün ve sırtın üzerine bir saç kesme makinesi ile tıraş edin (bkz. Şekil 1A), laparotomi planlanıyorsa karın üzerine uzanın (bkz. adım 5.3).
6. Fare anestezi uygulandıktan sonra, tercih edilen bir entübasyon kurulumunu kullanarak entübasyonu ve prosedürün geri kalanını ~ 37 ° C'de ısıtılmış bir mat üzerinde mikroskop altında gerçekleştirin (farede normotermiyi korumak için).
7. Ses tellerinin yeterli bir görünümünü elde ettikten sonra, endotrakeal tüp (ETT) olarak kullanılan 1 inçlik 20G'lik bir anjiyokateterin içine ucunda bir eğri bulunan ev yapımı bir tanıtıcı (Ek Şekil 1'e bakınız) yerleştirin. Tanıtıcının ucunu ve ardından ETT'yi ses telleri arasında ve ötesinde yönlendirin.
   NOT: Yemek borusuna yanlış entübasyonu önlemek için ETT'nin ses tellerinden geçtiğini görselleştirmek önemlidir. Entübasyon sırasında ses tellerinin zarar görmemesi için özen gösterilmelidir (yani entübasyon girişim sayısı 5 ile sınırlandırılmalı ve direnç karşılanırsa ETT ilerletilmemelidir).
8. ETT yerleştirildikten sonra, tanıtıcıyı çıkarın ve ETT'yi küçük bir hayvan ventilatörüne bağlayın. Doğru endotrakeal entübasyonu doğrulamak için simetrik göğüs yükselişini gözlemleyin. Ventilatör ayarları dakikada 100-105 nefes ve solunan oksijen oranı %100 olmalıdır. Tidal hacim 0.35 mL ve pozitif ekspirasyon sonu basıncı 1 cm H₂O'dur.
   NOT: Kazara özofagus entübasyonu derhal düzeltilmezse ölüme yol açacağından, karın yerine göğsün yükseldiğinden emin olun.
9. Yerinde olduğu onaylandıktan sonra, ETT'yi fare burnunun etrafına 5 cm'lik 1 inçlik bir ipek bant şeridi ile sabitleyin ve ETT'nin ağızdan dışarı kaymaması için ETT ve burun ile yeterli teması sağlayın (bkz. Şekil 1B-C).
10. Ameliyat boyunca yeterli anesteziyi korumak için, oksijen akışına paralel olarak% 1 -% 1.5 izofluran uygulayın.

2. Torakotomi

1. Fareyi, her iki ön pençe sol üst köşeye bantlı, sağ arka pençe sol alt köşeye bantlanmış ve sol arka pençe sağ alt köşeye bantlanmış olarak sağ yanal dekübit konumuna getirin (bantlama için Şekil 2G'ye bakın).
2. En az 3 alternatif povidon iyot turu ve ardından% 70 alkol uygulaması ile sol göğsün üzerindeki cilt ile dezenfekte edin.
3. Ön aksiller çizgiden arka aksiller çizgiye kadar 4^{. interkostal} boşluk üzerinde, üstteki cildi açmak için makas kullanarak bir kesi yapın (bkz. Şekil 2A). 4^{. interkostal} boşluk, orta aksiller çizgide aksillanın yaklaşık 1 cm altında yer alır.
4. Kan kaybını en aza indirmek için, elde tutulan bir koter kalemi kullanarak deri altı ve kas katmanlarındaki görünür kan damarlarını pıhtılaştırın.
5. Latissimus dorsi ve serratus anterior kaslarını makas kullanarak cilt kesisinin uzunluğu boyunca keskin bir şekilde bölün (bkz. Şekil 2B).
6. İnce kavisli forseps kullanarak, 4^{. kaburgayı} dikkatlice yükseltin (alttaki akciğere zarar vermemeye dikkat edin) ve 5. interkostal boşluğa girmek için 4^{. kaburganın} hemen üzerinde ince bir makasla kesin bir keskin nişancı yapın (bkz. Şekil 2C). İnterkostal nörovasküler demetin yaralanmasını önlemek için torakotomiyi 5^{. kaburganın} altında değil, 4^{. kaburganın} üzerinde gerçekleştirin.
7. Negatif plevral boşluk basıncı kaybolduğunda ve akciğer göğüs duvarından geri çekildiğinde, torakotomiyi 5^{. kaburganın} hemen üzerindeki 4^{. interkostal} boşlukta öne ve arkaya doğru uzatın (bkz. Şekil 2D-E). Kesinin tüm uzunluğu, genellikle ~ 1 cm olmak üzere tüm akciğeri açığa çıkaracak kadar uzun olmalıdır.
   NOT: Torakotomi öne doğru çok fazla uzatılırsa iç meme arteri kanaması meydana gelebilir - karşılaşılırsa, aşırı kan kaybını önlemek için bu koterize edilmelidir.
8. Kaburga boşluğunu açmak için iki kaburga ekartörü uygulayın ve yeterli görselleştirme için en az 1^cm2'lik bir çalışma penceresi sağlayın (bkz. Şekil 2F-G).

3. Hilar kelepçe uygulaması

1. İki uçlu pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, sol akciğeri sefalad yükselterek ve ardından yarı saydam inferior pulmoner ligamenti kör bir şekilde bölerek hareket ettirin (bkz. Şekil 3A-B).
   NOT: Bunu akciğeri yırtmadan gerçekleştirmek zorsa, alt pulmoner ligament de ince makas kullanılarak keskin bir şekilde bölünebilir.
2. Akciğeri öne doğru yansıtın, böylece arka sol pulmoner hilus görselleştirilebilir. 6-0 ipek bağdan ~10 cm'ye kadar bir parça kesin ve bu bağın orta noktasını hilumun arkasına yerleştirin (bkz. Şekil 3C).
3. Ardından, kravatın üzerine uzanmak için sol akciğeri arkaya doğru çevirin ve kravatın her iki ucunu öne doğru çekin (bkz. Şekil 3D).
4. Kravatın iki serbest ucu (A ve B) ile, forseps ve kavisli bir sivrisinek kelepçesi ile ters çevrilebilir bir kayma düğümü aletle bağlayın. Adım 3.4.1 ve 3.4.2'deki ayrıntılı açıklamaya bakın. Sıcak iskemik zaman, slip düğümün bağlanmasıyla başlar. Düğüm bağlandıktan sonra sol akciğer artık her ventilatör nefesinde şişmemelidir. Perfüzyonun kesilmesi anlamına gelen soluk beyaz olmalıdır.
   NOT: Düğümün hilumun ortasına oturduğundan emin olmak için özen gösterilmelidir, yanlışlıkla sol atriyumu merkeze ve akciğer parankimini yanlara sıkıştırmaktan kaçınmalıdır (bkz. Şekil 3F).
   1. Kelepçe baskın elde, forseps baskın olmayan eldeyken, A'nın ucunu forseps ile tutun ve A'nın orta noktasını kapalı kelepçenin etrafına bir kez sarın (bkz. Şekil 3E).
   2. B'nin orta noktasını kelepçe ile kavrayın ve kaymayı sıkıştırmak için iki elinizle çekin. B'nin ucunun düğümü çekmesine izin vermeyin, bu düğümü geri döndürülemez hale getirir. Düğümü bağladıktan sonra, B'nin düğümden çıkan bir ilmek olmalı, A ise düz olmalıdır (bkz. Şekil 3F). Düğüm, B'nin ucunu çekerek serbest bırakılabilir.
5. Sol akciğerin şişmemesine neden olması gereken ETT'den ventilatöre çıkış tüpünü manuel olarak tıkayarak bronşun yeterli tıkandığını onaylayın (bkz. Şekil 3G). Pulmoner arter ve venlerin kıkırdaklı bronşlara göre daha fazla katlanması nedeniyle bronşiyal tıkanıklık ile damar tıkanıklığı olduğu varsayılır.
6. Hiler klemp uygulandıktan sonra, sıcak iskemi döneminde hissedilmeyen sıvı kayıplarını en aza indirmek için cilt kesisini 6-0 naylon sütür kullanarak basit bir kesintili dikişle kapatın.

4. Hilar kelepçesinin serbest bırakılması

1. İstenilen sıcak iskemi döneminden sonra, ipek bağın kısa serbest ucunu nazikçe çekerek düğümü serbest bırakın ( Şekil 3F ve adım 3.4'ten B). Slipknot'un serbest bırakılmasının ardından reperfüzyon süresini başlatın.
   NOT: Bağın serbest bırakılmasını takiben, akciğer ventilasyonu, şimdi sol akciğerin genişlemesine neden olması gereken ETT çıkışının tekrar manuel olarak tıkanmasıyla doğrulanabilir. Yine, perfüzyon akciğerin şişmesi ile ima edilir, ancak akciğerin pembeleşmesi ile de doğrulanabilir (bkz. Şekil 4A).
2. Reperfüzyon döneminde, duyarsız kayıpları en aza indirmek için göğsü üç kat halinde kapatın. İlk olarak, 4^{. kaburga} boşluğunu 6-0 naylon dikişle tek bir dikişle, bir ısırık 4^{. kaburganın} hemen üzerinde ve bir ısırık 6^{. kaburganın} hemen üzerinde olacak şekilde kapatın (bkz. Şekil 4B-C). İyatrojenik pnömotoraks riskini en aza indirmek için bunu maksimum akciğer şişirme seviyesine bağlayın (bkz. Şekil 4D-E).
3. Ardından, 6-0 naylon sütür ile basit bir koşu dikişi kullanarak kas tabakasını kapatın.
4. Son olarak, cilt kesisini 6-0 naylon sütür ile basit bir kesikli dikişle kapatın (bkz. Şekil 4F). Uyanık hayvanların kesilerinde toplanma ve tam yara ayrışmasına yol açma riski nedeniyle cilde dikiş atmaktan kaçının.
5. Bu noktadan itibaren istenilen reperfüzyon süresi sonunda akciğer direkt olarak çıkarılabilir. ABG değerlendirmesi isteniyorsa, adım 5'e bakın. Kurban edilmeden önce ek intravenöz enjeksiyon isteniyorsa, adım 6'ya bakın. Bu terminal bir ameliyattır.
6. Reperfüzyon süresinin birkaç saatten fazla olması amaçlanıyorsa, farenin anesteziden uyanmasına ve ekstübe etmesine izin vermek için izofluranı kapatın. Ekstübasyon kriterleri arasında pençe sıkışması ile seğirme ve spontan solunum ve hareket yer alır. Bir fareyi ketamin ve izofluran anestezisinden uyandırmak tipik olarak 30-45 dakika sürer. Bu bir hayatta kalma ameliyatıdır.
   1. Hayatta kalma ameliyatı için, ameliyattan kaynaklanan sıvı kayıplarını hesaba katmak için deri altına 1 mL ılık salin enjekte edin. Ağrı kontrolü için ameliyattan önce deri altına buprenorfin (doz 0.05 - 0.1 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin. Ameliyattan sonra en az 3 gün boyunca her 4-6 saatte bir anesteziyi tekrarlayın. Ek ağrı kontrolü için insizyon boyunca bir bupivakain bloğu düşünün.

5. ABG değerlendirmesi

NOT: ABG ölçümü isteniyorsa, bu en iyi sol ventrikülden arteriyel kan aspirasyonu ile elde edilir. ABG'nin sadece sol akciğer fonksiyonunu yansıttığını tespit etmek için, bu arteriyel kan, sağ hilusun klemplenmesinden yaklaşık 4 dakika sonra elde edilmelidir^22,23, bu süre zarfında sadece sol akciğer oksijenasyon ve ventilasyon gerçekleştirir.

1. Hiler klempten sonra fare anesteziden uyandırılmışsa, fareyi 1. adıma göre yeniden uyuşturun ve entübe edin.
2. İstenen reperfüzyon süresinin bitiminden yaklaşık 15-20 dakika önce, fareyi sırtüstü yatırın ve dört uzvunu da bantla sabitleyin.
   NOT: Reperfüzyonun bitiminden önce aşağıdaki adımların gerçekleştirilmesi için yeterli zaman ayrılmalıdır. Karın ve göğsü açmak için özel zamanlama, cerraha ve deneyimlerine bağlı olarak değişecektir.
3. Kasık kemiğinden ksifoide kadar orta hat laparotomisi yapın, cildi ve ardından karın duvarını linea alba boyunca makasla kesin (bkz. Şekil 5A-B).
4. Ksifoidde, laparotomiyi en alt kaburganın eğrisini takip ederek ön aksiller çizgiye sola ve sağa uzatın (bkz. Şekil 5C).
5. Karından itibaren, göğse girmek için orta hattaki ön diyaframı kesin ve kalbe zarar vermemek için çok derine inmemeye dikkat edin (bkz. Şekil 5D-E). Ardından, ön diyafram kesisini en alt kaburga boyunca ön aksiller çizgiye sola ve sağa uzatın (Şekil 5D'deki beyaz noktalı çizgiye bakın).
6. Kapaklı bir torakotomi oluşturmak için bilateral kaburgaları ön aksiller çizgi boyunca, aksillaya doğru yukarı doğru uzanan şekilde bölün. Ardından, kalbin ve iki taraflı akciğerlerin tam olarak açığa çıkmasına izin veren ön göğüs duvarını (sternum ve iki taraflı ön kaburgalar) sefaladını yansıtın ( Şekil 5F'deki beyaz noktalı çizgilere bakın).
7. Retraksiyonu kolaylaştırmak için sefalad çevrilmiş ön göğüs duvarına bir kelepçe uygulayın. Göğsün görselleştirilmesini iyileştirmek için diyaframı orta hatta kavisli bir sivrisinek kelepçesi ile aşağı doğru geri çekin (bkz. Şekil 5F).
8. Sağ akciğeri (4 loblu) tam olarak harekete geçirmek için, orta hattı geçerek sol göğse uzanan aksesuar lobu tekrar sağ göğse geri koyun (bkz. Şekil 5G-H). Bu lobu sol göğse bağlayan ince bir bağ vardır - bunu pamuk uçlu aplikatörlerle kör bir şekilde veya makasla keskin bir şekilde bölün.
   NOT: Bu aksesuar lob, inferior vena kava (IVC) ile orta hattın posteriorunu geçer, bu nedenle bu manevra sırasında IVC'ye zarar vermemeye dikkat edilmelidir.
9. Tüm loblar sağ göğse geri döndüğünde, sağ akciğerin tamamını öne doğru yansıtın ve sağ hilusun arkasına başka bir 6-0 ipek kravat (~ 10 cm'ye kadar kesilmiş) yerleştirin. Ardından, sağ akciğeri kravatın üzerinden göğsüne geri yerleştirin.
10. Sağ akciğerin dört lobunu da çevrelemeye özen göstererek, adım 3.4'te anlatılan tekniğin aynısını kullanarak sağ hilumun etrafına başka bir düğüm atın. Bu sağ hiler klemp adımı, reperfüzyonun bitiminden yaklaşık 4 dakika önce olacak şekilde zamanlanmalıdır.
11. 1 cc tüberkülin şırıngasına 1/2 inç 31G iğneyi yaklaşık 200 μL heparin 1000 birim / mL ile kaplayın. Bunu yapmak için, heparin hacmini artırın ve heparinin şırınganın tüm içini kaplamasını sağlamak için pistonu tekrar tekrar 3-4 kez ileri geri çekin. Bu, cerrahi istasyondan ABG makinesine taşıma sırasında aspire edilen kanın pıhtılaşma riskini en aza indirmek için yapılır.
12. Sağ hiler klemplemeden 4 dakika sonra, sol ventrikülden gelen arteriyel kanı heparin kaplı şırıngaya aspire edin (bkz. Şekil 5I). Ventriküler septumu delmekten ve yanlışlıkla venöz sağ ventrikül kanını aspire etmekten kaçınmaya dikkat edin. Daha koyu sağ ventrikül ile daha parlak sol ventrikül arasında net bir renk farkı vardır (bkz. Şekil 5I ek). İğneyi sol boyna doğru eğin. Bir ABG'yi (~ 150 μL) çalıştırmak için yeterli kan elde etmek için birden fazla ponksiyon gerekebilir.
    NOT: Sağ hiler klempin 4 dakikası sırasında, fare yaklaşmakta olan ölümün habercisi olan agonal solunum sergilemeye başlayabilir. Böyle bir durumda, kalp durmasından önce arteriyel kan hızlı bir şekilde aspire edilmelidir. Atmayan bir kalpten kan aspire etmek mümkün değildir.
13. Diğer ölçümlerin yanı sıra oksijen doygunluğu, kısmi oksijen basıncı, kısmi karbondioksit basıncı elde etmek için arteriyel kanı bir ABG makinesinde çalıştırın. ABG toplama ve/veya antikor tedavisinden sonra fareye ötenazi yapın (bkz. adım 6).

6. Hücre ekstravazasyonunun ölçümü için intravenöz antikor enjeksiyonu

NOT: Bu teknik, daha önce yayınlandığı gibi, fedakârlıktan önce IVC'ye intravenöz olarak florokrom etiketli antikorların enjeksiyonu ve ardından akış sitometrik analizi yoluyla hücre ekstravazasyonunu belirlemek için kullanılabilir¹⁸. Kısaca intravasküler nötrofiller, nötrofil spesifik anti-Ly6G antikorları kullanılarak interstisyel nötrofillerden ayırt edilebilir. Floresein izotiyosiyanat etiketli (FITC etiketli) anti-Ly6G (klon 1A8), kurban edilmeden 5 dakika önce intravenöz olarak enjekte edilir ve bu da dolaşımdaki intravasküler nötrofilleri etiketler. Kullanılan FITC-Ly6G antikorunun konsantrasyonu, 200 μL fosfat tamponlu salin içinde seyreltilmiş 100 ng'dir. Daha sonra, akış sitometrisi için sol akciğerden tek hücreli süspansiyon hazırlandıktan sonra, tüm nötrofiller allofikosiyanin etiketli (APC etiketli) anti-Ly6G (klon 1A8) ile etiketlenir. Bu nedenle, APC-Ly6G ⁺ FITC-Ly6G ⁺ nötrofiller intravasküler iken APC-Ly6G ⁺ FITC-Ly6G^- ekstravasküler veya interstisyeldir. Bu teknik, örneğin anti-Ly6C antikorlarına sahip monositlere, anti-CD19 antikorlarına sahip B hücrelerine uyarlanabilir.

1. İstenilen antikoru, şırınga içindeki hava kabarcıklarını en aza indirmeye dikkat ederek 5/16 inç 31G iğneli 3/10 cc'lik bir şırıngaya yükleyin. Adım 6.5'te IVC'ye intravenöz enjeksiyon için bunu kullanın.
2. Adım 5.3-5.4'e göre laparotomi yapın.
3. Laparotomi sonrasında, iki sivri uçlu pamuk uçlu aplikatör kullanarak sağ medial viseral rotasyonu künt bir şekilde gerçekleştirin. Bir farede bu, IVC'nin net bir şekilde görülmesini sağlayacak olan karnın soluna doğru tüm bağırsağın boşaltılmasıyla yapılır (bkz. Şekil 6A).
4. IVC'nin üzerindeki yağı pamuk uçlu aplikatörlerle kör bir şekilde temizleyin.
5. Antikor solüsyonunu damar delinmesi yoluyla IVC'ye enjekte edin (bkz. Şekil 6B). İğnenin çıkarılmasından sonra, hemostatik olana kadar (genellikle yaklaşık 2-3 dakika) damar delinme bölgesine hemen bir pamuklu çubukla hafif bir baskı uygulayın.
6. IVC üzerine baskı uygulamaya devam etmek için içi boşaltılmış bağırsağı pamuklu çubuk üzerinde karın içine geri koyun (bkz. Şekil 6C).
7. Sol akciğeri çıkarmak için 5.5-5.7 adımlarına göre kapaklı torakotomi yapın. Kurban ve hasattan önce antikorların sistemik olarak dolaşması için en az 5 dakika kalmasına izin verin. ABG toplama ve / veya antikor tedavisinden sonra fareye ötenazi yapın.

7. Histoloji (H & E) boyama

1. Sol akciğerin formalin fiksasyonu ve parafin gömülmesini ve 5 μm kalınlığa kadar kesit alınmasını takiben, slaytı ksilen içinde deparafinize edin (iki 10 dakikalık yıkama).
2. Sıralı etanol yıkamalarında dehidrat: %100 ile 2x 5 dk, %95 ile 1x 2 dk yıkama ve %70 etanol ile 1x 2 dk yıkama. Daha sonra deiyonize suda durulayın.
3. Slaytı hematoksilen ile 2-4 dakika boyayın, ardından 5 dakika veya berraklaşana kadar deiyonize su ile yıkayın. Hematoksilen boyamanın kesin süresinin dokuya ve istenen nükleer boyama yoğunluğuna göre optimize edilmesi gerekecektir.
4. Lekeleri ayırt etmek için tanımlayıcı solüsyonda 30 saniye yıkayın, ardından 2 dakika suda yıkayın. Mavi renk oluşturan solüsyonda 30 saniye yıkayın, ardından 2 dakika suda yıkayın.
5. % 95 etanol 15x'e batırarak daha fazla kurutun. Eozin içinde 1 dakika boyayın.
6. 2 dakika etanol yıkama (2x) ile dehidre edin, ardından 2 dakika ksilen yıkama (2x) yapın. Montaj ortamını ve kapak kızağını uygulayın.

Sonuçlar

Sol hiler klempleme sonrası, sol akciğere atfedilen arteriyel kandaki (PaO₂) kısmi oksijenasyon basıncı ~100 mmHg olup, sahte torakotomi sonrası ~500 mmHg'ye kıyasla anlamlı derecede düşüktür (Şekil 7A, n=6-7). Dikkat çekici bir şekilde, sahte torakotomiler B6 farelerinde, yalnızca sol akciğere atfedilen değerleri temsil eden 4 dakikalık sağ hiler klemplemeden 4 dakika sonra ABG ölçümü ile gerçekleştirildi. Hiler klempli sol akciğerin H&E boyalanması, h...

Tartışmalar

Bu çalışmada, pulmoner arter ve venler ile bronşları tıkayan sol hilusa bir slipknot uygulanarak sıcak iskemi ve ardından reperfüzyon yapılan bir hiler klemp tekniği tarif edilmiştir. Hiler klemplemeden sonra, sol akciğer histoloji, akış sitometrisi, toplu veya tek hücre dizilimi ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu gibi çeşitli deneysel teknikler için hasat edilebilir. Ek olarak, kan ve dalak sistemik etkileri incelemek için kullanılabilirken, iskemik olmayan sağ akciğer iç kontrol görevi g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection