Akciğer İskemisi Reperfüzyon Hasarının Murin Sol Pulmoner Hiler Klemp Modeli

Özet

Protokol, fare modellerinde akciğer iskemi-reperfüzyon hasarını incelemek için kullanılabilecek uygulanabilir, güvenilir ve tekrarlanabilir bir sol pulmoner hiler klempleme yöntemini özetlemektedir.

Özet

Akciğer nakli sırasında iskemi reperfüzyon hasarı (IRI), primer greft disfonksiyonu, akut ve kronik rejeksiyon ve mortalite dahil olmak üzere nakil sonrası komplikasyonlar için majör bir risk faktörüdür. IRI'nin temellerini inceleme çabaları, sol akciğer hiler klemplemesinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir fare modelinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu model, anestezi uygulanmış ve entübe edilmiş bir farede gerçekleştirilen cerrahi bir prosedürü içerir. Sol torakotomi yapılır, ardından dikkatli akciğer mobilizasyonu ve sol pulmoner hilus diseksiyonu yapılır. Hiler klemp, sol ana gövde bronşundan arteriyel girişi, venöz çıkışı ve hava akışını durduran bir kayma ile pulmoner hilusun geri dönüşümlü sütür ligasyonunu içerir. Reperfüzyon, dikişin dikkatli bir şekilde çıkarılmasıyla başlatılır. Laboratuvarımız güncel incelemelerde deneysel model için 30 dk iskemi ve 1 saat reperfüzyon kullanmaktadır. Bununla birlikte, bu zaman dilimleri belirli deneysel soruya bağlı olarak değiştirilebilir. Kurban edilmeden hemen önce, elde edilen PaO₂ değerlerinin sadece yaralı sol akciğere atfedildiğinden emin olmak için 4 dakikalık bir sağ hiler klempleme periyodundan sonra sol ventrikülden arteriyel kan gazı alınabilir. Ayrıca, kurban edilmeden önce incelenecek hücre(ler) için spesifik florokrom etiketli bir antikorun intravenöz enjeksiyonunu içeren akış sitometrisi ile hücre ekstravazasyonunu ölçmek için bir yöntem de tarif ediyoruz. Sol akciğer daha sonra akış sitometrisi, donmuş veya sabitlenmiş, parafine gömülü immünohistokimya ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu için hasat edilebilir. Bu hiler klemp tekniği, IRI'nin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanır. Temsili sonuçlar, sol akciğer oksijenasyonunun azaldığını ve hiler klempleme sonrası akciğer hasarının histolojik kanıtlarını ortaya koymaktadır. Bu teknik, mikrocerrahi deneyimi olan ve olmayan personel tarafından kolayca öğrenilebilir ve çoğaltılabilir, bu da güvenilir ve tutarlı sonuçlara yol açar ve akciğer IRI'sini incelemek için yaygın olarak benimsenen bir model olarak hizmet eder.

Giriş

Organ nakli sırasında IRI, primer greft disfonksiyonu ve daha sonraki greft reddi atakları için önemli bir risk faktörüdür ^1,2. Transplantasyon sırasında sıcak iskemi süresi, donör aort kros klempinden soğuk perfüzyonun başlanmasına ve organın buzdan çıkarılmasından organ implantasyonuna kadar geçen süre olarak tanımlanır. Soğuk hava deposu süresi, soğuk perfüzyonun başlamasından organın buzdan çıkarılmasına kadar geçen süre olarak tanımlanır³. Sıcak iskemi, daha sonraki organ fonksiyonları için soğuk iskemi ^4,5,6'dan....

Protokol

Tüm çalışmalar Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar, Ulusal Bilimler Akademisi tarafından hazırlanan ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Kılavuz, 8^{. baskı 21} ve Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği tarafından formüle edilen laboratuvar hayvanı bakımı ilkelerine uygun olarak insancıl bakım aldı.

1. Anestezi ve entübasyon

1. En az 25 g ağırlığında bir fare seçin. Bu, ses telleri arasındaki daha büyük delik nedeniyle daha kolay entübasyonu kola....

Tartışmalar

Bu çalışmada, pulmoner arter ve venler ile bronşları tıkayan sol hilusa bir slipknot uygulanarak sıcak iskemi ve ardından reperfüzyon yapılan bir hiler klemp tekniği tarif edilmiştir. Hiler klemplemeden sonra, sol akciğer histoloji, akış sitometrisi, toplu veya tek hücre dizilimi ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu gibi çeşitli deneysel teknikler için hasat edilebilir. Ek olarak, kan ve dalak sistemik etkileri incelemek için kullanılabilirken, iskemik olmayan sağ akciğer iç kontrol görevi g.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection