Modello murino di morsetto ilare polmonare sinistro di lesione da riperfusione da ischemia polmonare

Riepilogo

Il protocollo delinea un metodo fattibile, affidabile e riproducibile di clampaggio ilare polmonare sinistro che può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione polmonare in modelli murini.

Abstract

Il danno da ischemia e riperfusione (IRI) durante il trapianto di polmone è un importante fattore di rischio per le complicanze post-trapianto, tra cui la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto acuto e cronico e la mortalità. Gli sforzi per studiare le basi dell'IRI hanno portato allo sviluppo di un modello murino affidabile e riproducibile di clamping ilare del polmone sinistro. Questo modello prevede una procedura chirurgica eseguita in un topo anestetizzato e intubato. Viene eseguita una toracotomia sinistra, seguita da un'attenta mobilizzazione polmonare e dalla dissezione dell'ilo polmonare sinistro. Il morsetto ilare comporta la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare con un nodo scorsoio, che interrompe l'afflusso arterioso, il deflusso venoso e il flusso d'aria attraverso il bronco principale sinistro. La riperfusione viene avviata con un'attenta rimozione della sutura. Il nostro laboratorio utilizza 30 minuti di ischemia e 1 ora di riperfusione per il modello sperimentale nelle attuali indagini. Tuttavia, questi periodi di tempo possono essere modificati a seconda della specifica domanda sperimentale. Immediatamente prima del sacrificio, l'emogasanalisi arteriosa può essere prelevata dal ventricolo sinistro dopo un periodo di 4 minuti di clampaggio ilare destro per garantire che i valori di PaO₂ ottenuti siano attribuiti al solo polmone sinistro danneggiato. Descriviamo anche un metodo per misurare lo stravaso cellulare con la citometria a flusso, che prevede l'iniezione endovenosa di un anticorpo marcato con fluorocromo specifico per le cellule da studiare prima del sacrificio. Il polmone sinistro può quindi essere prelevato per la citometria a flusso, congelato o fissato, l'immunoistochimica inclusa in paraffina e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Questa tecnica di clamp ilare consente uno studio dettagliato dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dell'IRI. I risultati rappresentativi rivelano una diminuzione dell'ossigenazione del polmone sinistro e l'evidenza istologica di danno polmonare a seguito di clamping ilare. Questa tecnica può essere facilmente appresa e riprodotta da personale con e senza esperienza microchirurgica, portando a risultati affidabili e coerenti e fungendo da modello ampiamente adottabile per lo studio dell'IRI polmonare.

Introduzione

L'IRI durante il trapianto d'organo è un importante fattore di rischio per la disfunzione primaria del trapianto e per i successivi episodi di rigetto del trapianto ^1,2. Durante il trapianto, il tempo di ischemia calda è definito come il periodo di tempo che intercorre tra il cross-clamp dell'aorta del donatore e l'inizio della perfusione fredda e tra la rimozione dell'organo dal ghiaccio all'impianto dell'organo. Il tempo di conservazione a freddo è definito come il periodo di tempo che intercorre tra l'inizio della perfusione fredda e la rimozione dell'organo dal ghiaccio³. L'ischemia calda è più deleteria per la funzione d'organo successiva rispetto all'ischemia fredda ^4,5,6 e i suoi meccanismi sottostanti giustificano ulteriori studi in modelli preclinici. Inoltre, il trapianto di organi da donazione dopo morte cardiaca (DCD) è associato a tempi ischemici caldi più lunghi rispetto alla donazione tradizionale dopo morte cerebrale (DBD)⁷. Sebbene l'uso di donatori di DCD possa espandere il pool di donatori e aumentare l'utilizzo polmonare, sono necessari ulteriori studi preclinici per valutare gli effetti dell'ischemia calda sulla funzione polmonare post-trapianto. Di seguito, descriviamo un modello di IRI caldo nei topi tramite il morsetto ilare polmonare sinistro.

Diversi modelli animali di clampaggio ilare polmonare sono stati sviluppati e adattati negli ultimi anni e possono includere l'uso di un clamp microvascolare atraumatico 8,9,10,11,12,13, un laccio emostatico di Rumel^14,15 o una legatura della sutura¹⁶ come il morsetto ilare. Il punto cruciale del morsetto ilare è che deve essere reversibile e causare danni minimi o nulli alle strutture ilari in modo da poter ottenere la riperfusione. Qui, descriviamo la nostra tecnica di clamp ilare nei topi che prevede la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare sinistro con un nodo scorsoio. Questo metodo occlude l'afflusso arterioso polmonare, il deflusso venoso e il flusso d'aria dentro e fuori il bronco principale. Il vantaggio principale di un nodo scorsoio rispetto a un morsetto vascolare, una clip o un laccio emostatico è che il torace può essere chiuso durante periodi prolungati di ischemia, riducendo così al minimo la perdita di liquidi insensibili e calore nel topo. Forniamo un protocollo per ottenere misurazioni affidabili dei gas nel sangue arterioso (ABG) e per misurare lo stravaso cellulare dopo il clampaggio ilare.

Questa tecnica di clamp ilare occupa un posto importante nello studio più ampio del trapianto di polmone. Rispetto ai piccoli modelli animali di trapianto di polmone ortotopico, la tecnica del clamp ilare può isolare gli effetti dell'IRI senza l'aggiunta di traumi anastomotici chirurgici o di allogenicità¹⁷. Inoltre, la tecnica del morsetto ilare può essere padroneggiata più facilmente e rapidamente rispetto al trapianto di polmone di topo. Infatti, utilizzando tecniche di clamp ilare, nell'ultimo decennio sono stati identificati diversi meccanismi importanti nella patogenesi dell'IRI, come il TLR4, la NADPH ossidasi e il recettore 14,18,19,20 dell'adenosina A2A. Nel seguente protocollo, presentiamo un metodo affidabile, insegnabile e riproducibile di clampaggio ilare come strumento per lo studio dell'IRI polmonare.

Protocollo

Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Washington University School of Medicine. Gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a^{edizione 21} preparata dalla National Academy of Sciences e pubblicata dal National Institutes of Health, e i Principi di cura degli animali da laboratorio formulati dalla National Society for Medical Research.

1. Anestesia e intubazione

1. Seleziona un mouse che pesi almeno 25 g. Ciò faciliterà l'intubazione a causa dell'orifizio più grande tra le corde vocali.
2. Iniettare nel topo per via intraperitoneale una miscela di ketamina (dose 100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (dose 10 mg/kg di peso corporeo). Questa miscela deve essere caricata in una siringa da 1/2 cc con un ago da 1/2 pollice da 29 G. Attendi circa 5 minuti affinché la ketamina faccia effetto: il topo non dovrebbe mostrare movimenti spontanei e non risponde a un pizzico di dita, il che conferma un'anestesia adeguata.
3. Iniettare buprenorfina (dose di 0,05 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea prima dell'intervento chirurgico per un ulteriore controllo del dolore.
4. Applicare un unguento oftalmico non medicato su entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione della cornea durante l'intervento chirurgico.
5. Radere il topo con un tagliacapelli sul torace sinistro e sulla schiena (vedere Figura 1A), estendendolo sull'addome se è prevista la laparotomia (vedere passaggio 5.3).
6. Una volta che il topo è stato anestetizzato, eseguire l'intubazione utilizzando una configurazione di intubazione preferita e il resto della procedura al microscopio su un tappetino riscaldato a ~37 °C (per mantenere la normotermia nel topo).
7. Dopo aver ottenuto una visione adeguata delle corde vocali, inserire un introduttore fatto in casa (vedi Figura 1 supplementare) con una curva all'estremità in un angiocatetere da 1 pollice da 20 G, che viene utilizzato come tubo endotracheale (ETT). Guidare la punta dell'introduttore e poi l'ETT tra e oltre le corde vocali.
   NOTA: È importante visualizzare l'ETT che passa attraverso le corde vocali per evitare una falsa intubazione nell'esofago. È necessario prestare attenzione per evitare lesioni alle corde vocali durante l'intubazione (ad esempio, il numero di tentativi di intubazione deve essere limitato a 5 e l'ETT non deve essere avanzato se si incontra resistenza).
8. Una volta inserito l'ETT, rimuovere l'introduttore e collegare l'ETT a un ventilatore per piccoli animali. Osservare l'innalzamento simmetrico del torace per confermare la corretta intubazione endotracheale. Le impostazioni del ventilatore devono essere di 100-105 respiri al minuto e una frazione di ossigeno inspirato del 100%. Il volume corrente è di 0,35 mL e la pressione positiva di fine espirazione è di 1 cm H₂O.
   NOTA: Assicurarsi che il torace piuttosto che l'addome si sollevi poiché l'intubazione esofagea accidentale porterà alla morte se non viene prontamente corretta.
9. Una volta confermato che è in posizione, fissare l'ETT con una striscia di 5 cm di nastro di seta da 1 pollice attorno al naso del mouse, assicurando un contatto adeguato con l'ETT e il naso in modo che l'ETT non scivoli fuori dalla bocca (vedere la Figura 1B-C).
10. Per mantenere un'anestesia adeguata durante l'intervento, somministrare isoflurano all'1%-1,5% in linea con il flusso di ossigeno.

2. Toracotomia

1. Posizionare il mouse in posizione di decubito laterale destro, con entrambe le zampe anteriori fissate con nastro adesivo all'angolo in alto a sinistra, la zampa posteriore destra con nastro adesivo all'angolo in basso a sinistra e la zampa posteriore sinistra con nastro adesivo all'angolo in basso a destra (vedere la Figura 2G per il nastramento).
2. Disinfettare con la pelle sul torace sinistro con almeno 3 cicli alternati di iodio povidone seguiti da un'applicazione di alcol al 70%.
3. Eseguire un'incisione sul 4°^{spazio intercostale} dalla linea ascellare anteriore alla linea ascellare posteriore, utilizzando le forbici per aprire la cute sovrastante (vedere la Figura 2A). Il 4^° spazio intercostale si trova a circa 1 cm sotto l'ascella nella linea medio-ascellare.
4. Per ridurre al minimo la perdita di sangue, coagulare i vasi sanguigni visibili all'interno degli strati sottocutanei e muscolari utilizzando una penna cauterica portatile.
5. Dividere bruscamente i muscoli del gran dorsale e del dentato anteriore utilizzando le forbici lungo la lunghezza dell'incisione cutanea (vedi Figura 2B).
6. Utilizzando una pinza curva fine, sollevare con cautela la 4a^costola (facendo attenzione a non ferire il polmone sottostante) ed eseguire un taglio preciso con forbici sottili appena sopra la 5a^costola per entrare nel 4°^{spazio intercostale} (vedere Figura 2C). Eseguire la toracotomia sopra la 5a^costola piuttosto che sotto la^4a costola per evitare di ferire il fascio neurovascolare intercostale.
7. Una volta persa la pressione negativa della cavità pleurica e il polmone si allontana dalla parete toracica, estendere la toracotomia anteriormente e posteriormente nel 4°^{spazio intercostale} appena sopra la 5^{° costola} (vedi Figura 2D-E). L'intera lunghezza dell'incisione dovrebbe essere abbastanza lunga da esporre l'intero polmone, di solito ~ 1 cm.
   NOTA: Se la toracotomia viene estesa troppo anteriormente - se si verifica, può verificarsi un'emorragia dell'arteria mammaria interna per evitare un'eccessiva perdita di sangue.
8. Applicare due divaricatori di costole per aprire lo spazio delle costole, lasciando una finestra di lavoro di almeno 1 cm² per un'adeguata visualizzazione (vedere Figura 2F-G).

3. Applicazione del morsetto ilare

1. Utilizzando applicatori a due punte con punta di cotone, mobilizzare il polmone sinistro sollevandolo cefalicamente e quindi dividendo bruscamente il legamento polmonare inferiore traslucido (vedi Figura 3A-B).
   NOTA: Se questo è difficile da eseguire senza strappare il polmone, il legamento polmonare inferiore può anche essere diviso bruscamente usando le forbici sottili.
2. Riflettere il polmone anteriormente in modo che l'ilo polmonare posteriore sinistro possa essere visualizzato. Taglia un pezzo di cravatta di seta 6-0 a ~10 cm e posiziona il punto medio di questa cravatta posteriormente all'ilo (vedi Figura 3C).
3. Quindi, capovolgere il polmone sinistro posteriormente per appoggiare la cravatta e tirare entrambe le estremità della cravatta anteriormente (vedere Figura 3D).
4. Con le due estremità libere (A e B) della cravatta, legare a strumenti un nodo scorsoio reversibile con pinza e una pinza antizanzare curva. Vedere la descrizione dettagliata nei passaggi 3.4.1 e 3.4.2. Il tempo ischemico caldo inizia dopo la legatura del nodo scorsoio. Il polmone sinistro non dovrebbe più gonfiarsi ad ogni respiro del ventilatore una volta che il nodo è stato legato. Dovrebbe diventare bianco pallido, il che implica la cessazione della perfusione.
   NOTA: Prestare attenzione per assicurarsi che il nodo si trovi al centro dell'ilo, evitando di intrappolare inavvertitamente l'atrio sinistro centralmente e il parenchima polmonare lateralmente (vedi Figura 3F).
   1. Con il morsetto nella mano dominante e il forcipe nella mano non dominante, tenere l'estremità di A con il forcipe e avvolgere una volta il punto medio di A attorno al morsetto chiuso (vedere la Figura 3E).
   2. Afferrare il punto medio di B con il morsetto e tirare con entrambe le mani per stringere il nodo scorsoio. Non lasciare che l'estremità di B tiri attraverso il nodo, il che renderebbe il nodo irreversibile. Dopo aver fatto il nodo, B dovrebbe avere un anello che emana dal nodo, mentre A dovrebbe essere dritto (vedi Figura 3F). Il nodo può essere sciolto tirando l'estremità di B.
5. Confermare un'adeguata occlusione del bronco occludendo manualmente il tubo di deflusso dall'ETT al ventilatore, il che dovrebbe causare il non gonfiaggio del polmone sinistro (vedere Figura 3G). L'occlusione vascolare si presume con l'occlusione bronchiale data la maggiore collassabilità dell'arteria polmonare e delle vene rispetto al bronco cartilagineo.
6. Dopo l'applicazione del morsetto ilare, chiudere l'incisione cutanea con un semplice punto interrotto utilizzando una sutura di nylon 6-0, per ridurre al minimo le perdite di liquidi insensibili durante il periodo di ischemia calda.

4. Rilascio del morsetto ilare

1. Dopo il periodo desiderato di ischemia calda, rilasciare il nodo scorsoio tirando delicatamente l'estremità corta e libera della cravatta di seta (B dalla Figura 3F e passaggio 3.4). Iniziare il tempo di riperfusione al rilascio del nodo scorsoio.
   NOTA: Dopo il rilascio della fascetta, la ventilazione polmonare può essere confermata da una nuova occlusione manuale del deflusso dell'ETT, che ora dovrebbe causare l'espansione del polmone sinistro. Anche in questo caso, la perfusione è implicita con l'inflazione del polmone, tuttavia, può anche essere confermata dal polmone che si gonfia verso l'alto (vedi Figura 4A).
2. Durante il periodo di riperfusione, chiudere il torace in tre strati per ridurre al minimo le perdite insensibili. Per prima cosa, chiudere lo spazio della 4a^costola con un punto singolo con sutura di nylon 6-0, con un morso appena sopra la 4a^costola e un morso appena sopra la 6a^costola (vedi Figura 4B-C). Collegare questo al massimo gonfiaggio polmonare, per ridurre al minimo il rischio di pneumotorace iatrogeno (vedere Figura 4D-E).
3. Successivamente, chiudere lo strato muscolare utilizzando un semplice punto corrente con sutura di nylon 6-0.
4. Infine, chiudere l'incisione cutanea con un semplice punto interrotto con sutura in nylon 6-0 (vedi Figura 4F). Evitare di far scorrere i punti sulla pelle a causa del rischio che gli animali svegli si rompano l'incisione e portino alla completa deiscenza della ferita.
5. Da questo punto, il polmone può essere prelevato direttamente al termine del tempo di riperfusione desiderato. Se si desidera una valutazione ABG, vedere il passaggio 5. Se si desidera un'ulteriore iniezione endovenosa prima del sacrificio, vedere il passaggio 6. Questo è un intervento chirurgico terminale.
6. Se il tempo di riperfusione deve essere superiore a un paio d'ore, spegnere l'isoflurano per consentire al topo di svegliarsi dall'anestesia ed estubare. I criteri di estubazione includono contrazioni con pizzico della zampa e respirazioni e movimenti spontanei. Svegliare un topo dall'anestesia con ketamina e isoflurano richiede in genere 30-45 minuti. Questo è un intervento chirurgico di sopravvivenza.
   1. Per la chirurgia di sopravvivenza, iniettare 1 mL di soluzione salina calda per via sottocutanea per tenere conto delle perdite di liquidi dovute all'intervento chirurgico. Iniettare buprenorfina (dose 0,05 - 0,1 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea prima dell'intervento chirurgico per il controllo del dolore. Ripetere l'anestesia ogni 4-6 ore per almeno 3 giorni dopo l'intervento. Prendi in considerazione un blocco di bupivacaina lungo l'incisione per un ulteriore controllo del dolore.

5. Valutazione ABG

NOTA: Se si desidera la misurazione dell'ABG, è meglio ottenerla tramite aspirazione di sangue arterioso dal ventricolo sinistro. Per accertare che l'ABG rifletta solo la funzione polmonare sinistra, questo sangue arterioso deve essere ottenuto dopo circa 4 minuti di clamping dell'ilo destro^22,23, durante i quali solo il polmone sinistro esegue l'ossigenazione e la ventilazione.

1. Se il topo è stato svegliato dall'anestesia dopo il clamp ilare, anestetizzare nuovamente e intubare il topo secondo il passaggio 1.
2. Circa 15-20 minuti prima della fine del tempo di riperfusione desiderato, posizionare il topo supino, fissando tutti e quattro gli arti con del nastro adesivo.
   NOTA: Prima della fine della riperfusione, è necessario dedicare molto tempo all'esecuzione dei seguenti passaggi. I tempi specifici per aprire l'addome e il torace variano a seconda del chirurgo e della sua esperienza.
3. Eseguire la laparotomia della linea mediana dall'osso pubico allo xifoide, incidendo con le forbici la cute seguita dalla parete addominale lungo la linea alba (vedi Figura 5A-B).
4. Al xifoide, estendere la laparotomia a sinistra e a destra fino alla linea ascellare anteriore, seguendo la curva della costola più inferiore (vedi Figura 5C).
5. Dall'addome, incidere il diaframma anteriore nella linea mediana per entrare nel torace, facendo attenzione a non andare troppo in profondità per evitare di ferire il cuore (vedi Figura 5D-E). Quindi, estendere l'incisione del diaframma anteriore a sinistra e a destra fino alla linea ascellare anteriore, lungo la costola più inferiore (vedere la linea tratteggiata bianca nella Figura 5D).
6. Dividere le costole bilaterali lungo la linea ascellare anteriore, estendendosi verso l'alto verso l'ascella, per creare una toracotomia a conchiglia. Quindi, riflettere la parete toracica anteriore (sterno e costole anteriori bilaterali) cefalade, che consente la piena esposizione del cuore e dei polmoni bilaterali (vedere le linee tratteggiate bianche nella Figura 5F).
7. Applicare un morsetto sulla parete toracica anteriore che è cefalica capovolta per facilitare la retrazione. Ritrarre il diaframma verso il basso con una pinza antizanzare curva nella linea mediana per migliorare la visualizzazione del torace (vedere la Figura 5F).
8. Per mobilizzare completamente il polmone destro (che ha 4 lobi), riportare il lobo accessorio che si estende oltre la linea mediana nel torace sinistro nel torace destro (Figura 5G-H). C'è un sottile legamento che attacca questo lobo al torace sinistro: dividilo senza mezzi termini con applicatori con punta di cotone o bruscamente con le forbici.
   NOTA: Questo lobo accessorio attraversa la linea mediana posteriore alla vena cava inferiore (IVC), quindi è necessario prestare attenzione a non ferire l'IVC durante questa manovra.
9. Una volta che tutti i lobi sono tornati sul torace destro, riflettere l'intero polmone destro anteriormente e posizionare un'altra fascetta di seta 6-0 (tagliata a ~10 cm) posteriormente all'ilo destro. Quindi, riposizionare il polmone destro nel torace sopra la cravatta.
10. Legare un altro nodo scorsoio attorno all'ilo destro utilizzando la stessa tecnica descritta al punto 3.4, avendo cura di circondare tutti e quattro i lobi del polmone destro. Questo passaggio del morsetto ilare destro deve essere programmato in modo che sia circa 4 minuti prima della fine della riperfusione.
11. Rivestire un ago da 1/2 pollice da 31G su una siringa di tubercolina da 1 cc con circa 200 μL di eparina 1000 unità/mL. Per fare ciò, aspirare il volume di eparina e tirare ripetutamente lo stantuffo avanti e indietro 3-4 volte per consentire all'eparina di rivestire l'intero interno della siringa. Questo viene fatto per ridurre al minimo il rischio di coagulazione del sangue aspirato durante il trasporto dalla stazione chirurgica alla macchina ABG.
12. Dopo 4 minuti di clamping ilare destro, aspirare il sangue arterioso dal ventricolo sinistro nella siringa rivestita di eparina (vedere Figura 5I). Fare attenzione a evitare di perforare il setto ventricolare e di aspirare inavvertitamente sangue venoso del ventricolo destro. C'è una chiara differenza di colore tra il ventricolo destro più scuro e il ventricolo sinistro più luminoso (vedi Figura 5I nel riquadro). Inclinare l'ago verso il collo sinistro. Possono essere necessarie più punture per ottenere sangue sufficiente per eseguire un ABG (~150 μL).
    NOTA: Durante i 4 minuti di morsetto ilare destro, il topo può iniziare a mostrare una respirazione agonale che preannuncia la morte imminente. In tal caso, il sangue arterioso deve essere aspirato rapidamente prima dell'arresto cardiaco. Non è possibile aspirare il sangue da un cuore non pulsante.
13. Eseguire il sangue arterioso su una macchina ABG per ottenere la saturazione di ossigeno, la pressione parziale dell'ossigeno, la pressione parziale dell'anidride carbonica, tra le altre misurazioni. Sopprimere il topo dopo la raccolta dell'ABG e/o il trattamento con anticorpi (vedere passaggio 6).

6. Iniezione endovenosa di anticorpi per la misurazione dello stravaso cellulare

NOTA: Questa tecnica può essere utilizzata per determinare lo stravaso cellulare tramite iniezione endovenosa di anticorpi marcati con fluorocromo nell'IVC prima del sacrificio seguito da analisi citofluorimetrica, come precedentemente pubblicato¹⁸. In breve, i neutrofili intravascolari possono essere distinti dai neutrofili interstiziali utilizzando anticorpi anti-Ly6G specifici per neutrofili. L'anti-Ly6G marcato con isotiocianato di fluoresceina (FITC-marcato) (clone 1A8) viene iniettato per via endovenosa 5 minuti prima del sacrificio, che marca i neutrofili intravascolari circolanti. La concentrazione dell'anticorpo FITC-Ly6G utilizzato è di 100 ng diluito in 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi, dopo la preparazione della sospensione di una singola cellula dal polmone sinistro per la citometria a flusso, tutti i neutrofili vengono marcati con anti-Ly6G marcato con alloficocianina (marcato con APC) (clone 1A8). Pertanto, i neutrofili APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G⁺ sono intravascolari mentre APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G^- sono extravascolari o interstiziali. Questa tecnica può essere adattata, ad esempio, ai monociti con anticorpi anti-Ly6C, alle cellule B con anticorpi anti-CD19.

1. Caricare l'anticorpo desiderato in una siringa da 3/10 cc con ago da 5/16 pollici 31G, facendo attenzione a ridurre al minimo le bolle d'aria all'interno della siringa. Utilizzare questo per l'iniezione endovenosa nell'IVC al punto 6.5.
2. Eseguire la laparotomia secondo i passaggi 5.3-5.4.
3. Dopo la laparotomia, eseguire la rotazione viscerale mediale destra senza mezzi termini utilizzando due applicatori appuntiti con punta di cotone. In un topo, questo viene fatto eviscerando tutto l'intestino a sinistra dell'addome, il che consentirà una visione chiara dell'IVC (vedi Figura 6A).
4. Elimina il grasso sovrastante l'IVC senza mezzi termini con applicatori con punta di cotone.
5. Iniettare la soluzione di anticorpi nell'IVC tramite venipuntura (vedere Figura 6B). Dopo aver estratto l'ago, applicare immediatamente una leggera pressione con un batuffolo di cotone sul sito della venipuntura fino a quando non è emostatico (di solito circa 2-3 minuti).
6. Riposizionare l'intestino eviscerato nell'addome sopra il batuffolo di cotone per continuare ad applicare pressione sull'IVC (vedere Figura 6C).
7. Eseguire la toracotomia a conchiglia secondo i passaggi 5.5-5.7 per prelevare il polmone sinistro. Lasciare che gli anticorpi abbiano almeno 5 minuti per circolare sistemicamente prima del sacrificio e del raccolto. Sopprimere il topo dopo la raccolta di ABG e/o il trattamento con anticorpi.

7. Colorazione istologica (H&E)

1. Dopo la fissazione in formalina e l'inclusione in paraffina del polmone sinistro e il sezionamento a uno spessore di 5 μm, deparaffinizzare il vetrino in xilene (due lavaggi di 10 minuti).
2. Disidratare in lavaggi sequenziali con etanolo: 2 lavaggi da 5 minuti con il 100%, 1 lavaggio da 2 minuti con il 95% e 1 lavaggio da 2 minuti con etanolo al 70%. Quindi, sciacquare in acqua deionizzata.
3. Colorare il vetrino con ematossilina per 2-4 minuti, quindi lavare con acqua deionizzata per 5 minuti o fino a quando non scorre limpido. La durata precisa della colorazione con ematossilina dovrà essere ottimizzata in base al tessuto e all'intensità di colorazione nucleare desiderata.
4. Lavare in soluzione defininte per 30 s per differenziare le macchie, quindi lavare in acqua per 2 min. Lavare in soluzione di colorazione blu per 30 s, quindi lavare in acqua per 2 minuti.
5. Disidratare ulteriormente immergendo 15 volte in etanolo al 95%. Macchiare in eosina per 1 min.
6. Disidratare con 2 minuti di lavaggi con etanolo (2x), seguiti da 2 minuti di lavaggi con xilene (2x). Applicare il supporto di montaggio e il vetrino coprioggetto.

Risultati

Dopo il clamping ilare sinistro, la pressione parziale di ossigenazione nel sangue arterioso (PaO₂) attribuita al polmone sinistro è di ~100 mmHg, significativamente più bassa rispetto ai ~500 mmHg dopo la toracotomia fittizia (Figura 7A, n=6-7). Da notare che sono state eseguite toracotomie fittizie in topi B6 con misurazione ABG presa dopo 4 minuti di clamping ilare destro, che rappresentano valori attribuiti al solo polmone sinistro. La colorazione H&E del polmone sinistro co...

Discussione

Descriviamo una tecnica di clamp ilare che prevede l'applicazione di un nodo scorsoio sull'ilo sinistro che occlude l'arteria polmonare e le vene e i bronchi per indurre l'ischemia calda seguita da riperfusione. Dopo il clampaggio ilare, il polmone sinistro può essere prelevato per una varietà di tecniche sperimentali come l'istologia, la citometria a flusso, il sequenziamento di massa o di singole cellule e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Inoltre, il sangue e la milza possono essere utilizzati per ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection