Мышиная модель прикорневого зажима левой легочной артерии при реперфузионном повреждении ишемии легких

Резюме

В протоколе изложен осуществимый, надежный и воспроизводимый метод пережатия левой легочной прикорневой мышцы, который может быть использован для изучения ишемии-реперфузионного повреждения легких на мышиных моделях.

Аннотация

Ишемическое реперфузионное повреждение (ИРИ) во время трансплантации легкого является основным фактором риска посттрансплантационных осложнений, включая первичную дисфункцию трансплантата, острое и хроническое отторжение и смертность. Усилия по изучению основ IRI привели к разработке надежной и воспроизводимой модели прикорневой фиксации левого легкого у мышей. Эта модель включает в себя хирургическую процедуру, выполняемую у анестезируемой и интубированной мыши. Выполняется левая торакотомия с последующей тщательной мобилизацией легких и рассечением левого легочного воротка. Прикорневой зажим включает в себя обратимое наложение швов на ворота легочной артерии с помощью узла, который останавливает артериальный приток, венозный отток и поток воздуха через левый основной стволовой бронх. Реперфузия инициируется тщательным снятием швов. В текущих исследованиях наша лаборатория использует 30 мин ишемии и 1 ч реперфузии для экспериментальной модели. Однако эти временные периоды могут быть изменены в зависимости от конкретного экспериментального вопроса. Непосредственно перед жертвоприношением можно получить газ артериальной крови из левого желудочка после 4-минутного периода пережатия правой прикорневой мышцы, чтобы убедиться, что полученные значения PaO₂ относятся только к поврежденному левому легкому. Мы также описываем метод измерения экстравазации клеток с помощью проточной цитометрии, который включает внутривенное введение меченного флуорохромом антитела, специфичного для изучаемой клетки (клеток) перед жертвоприношением. Затем левое легкое может быть собрано для проточной цитометрии, замороженной или фиксированной, иммуногистохимии со встроенным парафином и количественной полимеразной цепной реакции. Этот метод прикорневого зажима позволяет детально изучить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе ИРИ. Репрезентативные результаты свидетельствуют о снижении оксигенации левого легкого и гистологических признаках повреждения легких после прикорневой пережатия. Эта техника может быть легко изучена и воспроизведена персоналом с опытом микрохирургии и без него, что приводит к надежным и стабильным результатам и служит широко используемой моделью для изучения ИРИ легких.

Введение

ИРИ при трансплантации органов является основным фактором риска развития первичной дисфункции трансплантата и последующих эпизодов отторжения трансплантата ^1,2. Во время трансплантации время теплой ишемии определяется как период времени от перекрестного зажима донорской аорты до начала холодной перфузии и от извлечения органа изо льда до имплантации органа. Время хранения в холодильнике определяется как период времени от начала холодной перфузии до извлечения органа изо льда³. Теплая ишемия более вредна для последующей функции органов, чем холодовая ишемия ^4,5,6, и ее основные механизмы требуют дальнейшего изучения в доклинических моделях. Кроме того, трансплантация органов от донора после сердечной смерти (DCD) связана с более длительным периодом теплой ишемии, чем традиционное донорство после смерти мозга (DBD)⁷. В то время как использование доноров DCD может расширить пул доноров и повысить использование легких, необходимы дальнейшие доклинические исследования для оценки влияния теплой ишемии на функцию легких после трансплантации. Ниже мы опишем модель теплого ИРИ у мышей через левый легочный прикорневой зажим.

За последние несколько лет было разработано и адаптировано несколько животных моделей прикорневой фиксации легких, которые могут включать использование атравматического микрососудистого зажима 8,9,10,11,12,13, жгута Румеля ^14,15 или наложения швов¹⁶ в качестве прикорневого зажима. Суть прикорневого зажима заключается в том, что он должен быть обратимым и вызывать минимальное повреждение прикорневых структур или не вызывать их вовсе, чтобы можно было достичь реперфузии. В этой статье мы описываем нашу технику прикорневого зажима у мышей, которая включает в себя обратимое наложение швов на левую легочную артерию ворот с помощью узла. Этот метод окклюзирует приток легочной артерии, венозный отток и поток воздуха внутрь и наружу главного ствола бронха. Основное преимущество скользящего узла по сравнению с сосудистым зажимом, зажимом или жгутом заключается в том, что грудная клетка может быть закрыта в течение длительных периодов ишемии, тем самым сводя к минимуму неощутимые потери жидкости и тепла у мыши. Мы предоставляем протокол для получения надежных измерений газов артериальной крови (АГН) и для измерения экстравазации клеток после прикорневой пережатости.

Эта техника прикорневого зажима занимает важное место в более широком изучении трансплантации легких. По сравнению с моделями ортотопической трансплантации легких на мелких животных, техника прикорневого зажима может изолировать эффекты IRI без добавления хирургической травмы анастомотического или аллогенности^. Кроме того, техника прикорневого зажима может быть освоена легче и быстрее, чем трансплантация легких у мыши. Фактически, с помощью техники прикорневого зажима за последнее десятилетие было выявлено несколько важных механизмов патогенеза ИРИ, таких как TLR4, оксидаза NADPH и аденозиновый рецептор A2A 14,18,19,20. В следующем протоколе мы представляем надежный, обучаемый и воспроизводимый метод прикорневого зажима в качестве инструмента для изучения ИРИ легких.

протокол

Все исследования были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Вашингтонского университета. Животные получали гуманный уход в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию,^8-е издание²¹ , подготовленным Национальной академией наук и опубликованным Национальными институтами здравоохранения, и Принципами ухода за лабораторными животными, сформулированными Национальным обществом медицинских исследований.

1. Анестезия и интубация

1. Выберите мышь весом не менее 25 г. Это будет способствовать более легкой интубации за счет большего отверстия между голосовыми связками.
2. Внутрибрюшинно вводите мышке смесь кетамина (доза 100 мг/кг массы тела) и ксилазина (доза 10 мг/кг массы тела). Эту смесь следует загрузить в шприц объемом 1/2 куб. см с иглой 1/2 дюйма 29G. Подождите около 5 минут, пока кетамин начнет действовать - мышь не должна проявлять спонтанных движений и не реагирует на пощипывание пальца ноги, что подтверждает адекватную анестезию.
3. Вводите бупренорфин (доза 0,05 мг/кг массы тела) подкожно перед операцией для дополнительного обезболивания.
4. Нанесите немедикаментозную офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы избежать высыхания роговицы во время операции.
5. Побрейте мышь машинкой для стрижки на левой груди и спине (см. рисунок 1A), распространяя ее на брюшную полость, если планируется лапаротомия (см. шаг 5.3).
6. После того, как мышь будет обезболена, выполните интубацию с использованием предпочтительной интубационной установки, а оставшуюся часть процедуры под микроскопом на нагретом коврике при температуре ~37 °C (для поддержания нормотермии у мыши).
7. После достижения адекватного обзора голосовых связок вставьте самодельный интродьюсер (см. дополнительный рисунок 1) с изгибом на конце в 1-дюймовый ангиокатетер 20G, который используется в качестве эндотрахеальной трубки (ЭТТ). Проведите кончик проводника, а затем ЭТТ между голосовыми связками и мимо них.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно визуализировать ЭТТ, проходящую через голосовые связки, чтобы избежать ложной интубации в пищевод. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать травмирования голосовых связок во время интубации (т.е. количество попыток интубации должно быть ограничено 5, а ЭТТ не должна быть расширена при наличии сопротивления).
8. После установки ETT извлеките проводник и подключите ETT к аппарату искусственной вентиляции легких для мелких животных. Наблюдайте за симметричным подъемом грудной клетки, чтобы подтвердить правильность эндотрахеальной интубации. Настройки аппарата ИВЛ должны составлять 100-105 вдохов в минуту и доля вдыхаемого кислорода 100%. Дыхательный объем составляет 0,35 мл, положительное давление в конце выдоха – 1 см H₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что грудная клетка, а не брюшная полость, поднимается, так как случайная интубация пищевода приведет к смерти, если ее своевременно не скорректировать.
9. После подтверждения того, что ETT находится в нужном положении, закрепите ETT полоской длиной 5 см из шелковой ленты толщиной 1 дюйм вокруг носа мыши, обеспечивая достаточный контакт с ETT и носом, чтобы ETT не выскользнул изо рта (см. Рисунок 1B-C).
10. Для поддержания адекватной анестезии на протяжении всей операции вводите 1%-1,5% изофлуран в соответствии с потоком кислорода.

2. Торакотомия

1. Расположите мышь в правильном боковом положении пролежня так, чтобы обе передние лапы были прикреплены к верхнему левому углу, правая задняя лапа — к нижнему левому углу, а левая задняя лапа — к нижнему правому углу (см. Рисунок 2G для тейпирования).
2. Продезинфицируйте кожу над левой грудью не менее 3 чередующихся раундов повидон-йода с последующим нанесением 70% спирта.
3. Выполните разрез над^4-м межреберным пространством от передней подмышечной линии до задней подмышечной линии, используя ножницы для вскрытия вышележащей кожи (см. рисунок 2А). ^4-е межреберье расположено примерно на 1 см ниже подмышечной впадины по среднеподмышечной линии.
4. Чтобы свести к минимуму кровопотерю, коагулируйте видимые кровеносные сосуды в подкожном и мышечном слоях с помощью ручного ручки для прижигания.
5. Резко разделите широчайшие мышцы спины и передние зубчатые мышцы с помощью ножниц по длине разреза кожи (см. рисунок 2В).
6. С помощью тонко изогнутых щипцов осторожно поднимите^4-е ребро (стараясь не повредить нижележащее легкое) и сделайте точечный надрез тонкими ножницами чуть выше^5-го ребра, чтобы войти в^4-е межреберье (см. Рисунок 2C). Выполняйте торакотомию выше^5-го ребра, а не ниже^4-го ребра, чтобы избежать повреждения межреберного сосудисто-нервного пучка.
7. Как только отрицательное давление в плевральной полости будет потеряно и легкое оттянется от стенки грудной клетки, продлите торакотомию спереди и сзади в^4-м межреберье чуть выше^5-го ребра (см. Рисунок 2D-E). Вся длина разреза должна быть достаточной для обнажения всего легкого, обычно ~1 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечение из внутренней молочной артерии может произойти, если торакотомия слишком сильно распространена на кпереднюю часть - при обнаружении этого следует прижечь, чтобы избежать чрезмерной кровопотери.
8. Примените два ребра ребра, чтобы расширить пространство ребер, обеспечив рабочее окно не менее 1^см2 для адекватной визуализации (см. Рисунок 2F-G).

3. Применение прикорневого зажима

1. С помощью двухконечных аппликаторов с ватным наконечником мобилизуйте левое легкое, подняв его головной и затем тупо разделив полупрозрачную нижнюю легочную связку (см. рисунок 3A-B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если это сложно выполнить без разрыва легкого, нижнюю легочную связку также можно резко разделить с помощью тонких ножниц.
2. Отразите легкое спереди, чтобы можно было визуализировать заднюю левую легочную ворота. Отрежьте кусок шелковой галстука 6-0 до ~10 см и поместите середину этой галстука сзади к воротам (см. Рисунок 3C).
3. Затем переверните левое легкое кзади, чтобы положить поверх галстука, и потяните оба конца галстука спереди (см. рисунок 3D).
4. Двумя свободными концами (А и В) галстука инструмента завяжите двусторонний узел с щипцами и изогнутым противомоскитным зажимом. Подробное описание см. в шагах 3.4.1 и 3.4.2. Теплое ишемическое время начинается с завязывания узла. Левое легкое больше не должно раздуваться при каждом вдохе аппарата ИВЛ после того, как узел завязан. Она должна стать бледно-белой, что означает прекращение перфузии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует следить за тем, чтобы узел находился в середине воротника, избегая случайного защемления левого предсердия по центру и паренхимы легкого по бокам (см. Рисунок 3F).
   1. Держа зажим в доминирующей руке и щипцы в недоминантной руке, возьмитесь за конец А щипцами и один раз обмотайте середину А вокруг закрытого зажима (см. рисунок 3E).
   2. Возьмитесь зажимом за середину буквы B и потяните обеими руками, чтобы зажать узел. Не позволяйте концу буквы В протягиваться через узел, что может сделать узел необратимым. После завязывания узла у В должна быть петля, исходящая от узла, а у А должна быть прямая (см. рисунок 3F). Узел можно освободить, потянув за конец В.
5. Подтвердите адекватную окклюзию бронха путем ручной окклюзии отводящей трубки от ЭТТ к аппарату искусственной вентиляции легких, что должно привести к тому, что левое легкое не будет раздуваться (см. рисунок 3G). Окклюзия сосудов предполагается при окклюзии бронхов с учетом повышенной коллапсируемости легочной артерии и вен по сравнению с хрящевым бронхом.
6. После наложения прикорневого зажима закройте разрез кожи одним простым прерывистым швом с использованием нейлонового шва 6-0, чтобы свести к минимуму незаметные потери жидкости в период теплой ишемии.

4. Освобождение прикорневого зажима

1. После желаемого периода теплой ишемии освободите узел, осторожно потянув за короткий свободный конец шелкового галстука (В из рисунка 3F и шага 3.4). Начните время реперфузии после отпускания узла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После снятия уздечки вентиляция легких может быть подтверждена повторной ручной окклюзией оттока ЭТТ, что теперь должно вызвать расширение левого легкого. Опять же, перфузия подразумевается как раздувание легкого, однако она также может быть подтверждена розовым легким (см. рисунок 4A).
2. В период реперфузии закройте грудную клетку в три слоя, чтобы свести к минимуму неощутимые потери. Сначала закройте пространство^4-го ребра одним стежком нейлоновым швом 6-0, одним укусом чуть выше^4-го ребра и одним укусом чуть выше^6-го ребра (см. рисунок 4B-C). Свяжите это с максимальным раздуванием легких, чтобы свести к минимуму риск ятрогенного пневмоторакса (см. рисунок 4D-E).
3. Далее закройте мышечный слой с помощью простого бегового стежка с нейлоновым швом 6-0.
4. Наконец, закройте разрез кожи простым прерывистым швом с нейлоновым швом 6-0 (см. рисунок 4F). Избегайте наложения швов на кожу из-за риска того, что проснувшиеся животные могут ковыряться в их разрезе, что приведет к полному раскрытию раны.
5. С этого момента легкое может быть непосредственно извлечено по истечении желаемого времени реперфузии. Если требуется оценка ABG, см. шаг 5. Если перед жертвоприношением требуется дополнительная внутривенная инъекция, см. шаг 6. Это терминальная операция.
6. Если время реперфузии должно быть больше пары часов, выключите изофлуран, чтобы мышь могла проснуться от анестезии и провести экстубацию. Критерии экстубации включают подергивания с щипком и спонтанные вдохи и движения. Пробуждение мыши от кетаминовой и изофлурановой анестезии обычно занимает 30-45 минут. Это операция по выживанию.
   1. Для операции по выживанию введите 1 мл теплого физиологического раствора подкожно, чтобы компенсировать потерю жидкости во время операции. Вводите бупренорфин (доза 0,05 - 0,1 мг/кг массы тела) подкожно перед операцией для контроля боли. Повторяйте анестезию каждые 4-6 часов в течение как минимум 3 дней после операции. Рассмотрите возможность введения бупивакаиновой блокады вдоль разреза для дополнительного контроля боли.

5. Оценка ABG

ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется измерение АВГ, его лучше всего получить с помощью артериальной аспирации крови из левого желудочка. Чтобы убедиться, что АБГ отражает только функцию левого легкого, эта артериальная кровь должна быть получена примерно через 4 минуты после зажатия правого ворота^22,23, в течение которого только левое легкое осуществляет оксигенацию и вентиляцию.

1. Если мышь была выведена из наркоза после прикорневого зажима, повторно обезболите и интубируйте мышь в соответствии с шагом 1.
2. Примерно за 15-20 минут до окончания желаемого времени реперфузии расположите мышь на спине, зафиксировав все четыре конечности лентой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует выделить достаточно времени для выполнения следующих этапов до окончания реперфузии. Конкретное время вскрытия брюшной полости и грудной клетки будет варьироваться в зависимости от хирурга и его опыта.
3. Выполните лапаротомию по средней линии от лобковой кости до мечевидной кости, разрезая ножницами кожу, а затем брюшную стенку вдоль белой линии (см. рисунок 5A-B).
4. На мечевидной кости продлите лапаротомию влево и вправо до передней подмышечной линии, следуя изгибу самого нижнего ребра (см. Рисунок 5C).
5. С брюшной полости разрежьте переднюю диафрагму по средней линии, чтобы войти в грудную клетку, стараясь не проникать слишком глубоко, чтобы не повредить сердце (см. рисунок 5D-E). Затем продлите разрез передней диафрагмы влево и вправо до передней подмышечной линии, вдоль самого нижнего ребра (см. белую пунктирную линию на рисунке 5D).
6. Разделите двусторонние ребра вдоль передней подмышечной линии, простирающейся вверх к подмышечной впадине, чтобы создать торакотомию с раскладушкой. Затем отразите переднюю грудную стенку (грудину и двусторонние передние ребра) головной мозг, что позволяет полностью обнажить сердце и двусторонние легкие (см. белые пунктирные линии на рисунке 5F).
7. Наложите зажим на переднюю стенку грудной клетки, которая перевернута на голову, чтобы облегчить втягивание. Отведите диафрагму вниз с помощью изогнутого москитного зажима по средней линии для улучшения визуализации грудной клетки (см. рисунок 5F).
8. Чтобы полностью мобилизовать правое легкое (которое имеет 4 доли), верните добавочную долю, которая проходит за среднюю линию в левую грудную клетку, обратно в правую грудную клетку (см. рисунок 5G-H). К левой груди прилагается тонкая связка, прикрепляющая эту долю – разделите ее либо тупо аппликаторами с ватным наконечником, либо резко ножницами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта добавочная доля пересекает среднюю линию позади нижней полой вены (IVC), поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить IVC во время этого маневра.
9. Как только все доли вернутся к правой груди, отразите все правое легкое спереди и поместите еще одну шелковую галстук 6-0 (обрезанную до ~10 см) позади правой груди. Затем замените правое легкое обратно в грудную клетку поверх галстука.
10. Завяжите еще один узел вокруг правого ворота, используя ту же технику, что и в шаге 3.4, стараясь обхватить все четыре доли правого легкого. Этот шаг зажима правой прикорневой мышцы должен быть рассчитан примерно за 4 минуты до окончания реперфузии.
11. Нанесите 1/2-дюймовую иглу 31G на туберкулиновый шприц объемом 1 куб. см примерно 200 мкл гепарина 1000 единиц/мл. Для этого наберите объем гепарина и несколько раз потяните поршень вперед и назад 3-4 раза, чтобы гепарин мог покрыть всю внутреннюю часть шприца. Это делается для минимизации риска свертывания аспирированной крови во время транспортировки с хирургической станции на аппарат ABG.
12. Через 4 минуты после пережатия правой корточки аспирируйте артериальную кровь из левого желудочка в шприц, покрытый гепарином (см. рисунок 5I). Следите за тем, чтобы не допустить прокола межжелудочковой перегородки и непреднамеренной аспирации венозной крови правого желудочка. Существует четкая разница в цвете между более темным правым желудочком и более светлым левым желудочком (см. вставку рисунка 5I). Наклоните иглу к левой горловине. Для получения достаточного количества крови для проведения ABG (~150 μL) может потребоваться несколько проколов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 4 минут зажима правой мышцы мыши могут начать проявлять агональное дыхание, которое предвещает надвигающуюся смерть. В этом случае артериальная кровь должна быть немедленно аспирирована до остановки сердца. Аспирация крови из небьющегося сердца невозможна.
13. Запустите артериальную кровь на аппарате ABG, чтобы получить насыщение кислородом, парциальное давление кислорода, парциальное давление углекислого газа и другие измерения. Усыпьте мышь после сбора ABG и/или лечения антителами (см. шаг 6).

6. Внутривенное введение антител для измерения экстравазации клеток

Этот метод может быть использован для определения экстравазации клеток путем внутривенного введения антител, меченных флуорохромом, в НПВ перед жертвоприношением с последующим проведением проточного цитометрического анализа, как было опубликовано ранее¹⁸. Вкратце, внутрисосудистые нейтрофилы можно отличить от интерстициальных нейтрофилов с помощью нейтрофильно-специфических антител против Ly6G. Флуоресцеин-изотиоцианат-меченный (FITC-меченный) анти-Ly6G (клон 1A8) вводится внутривенно за 5 минут до жертвоприношения, который помечает циркулирующие внутрисосудистые нейтрофилы. Используемая концентрация антитела FITC-Ly6G составляет 100 нг, разведенных в 200 мкл фосфатно-солевого буфера. Затем, после приготовления суспензии одиночных клеток из левого легкого для проточной цитометрии, все нейтрофилы мечаются аллофикоцианином-меченным (APC-меченным) анти-Ly6G (клон 1A8). Таким образом, нейтрофилы APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G⁺ являются внутрисосудистыми, в то время как APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G^- являются внесосудистыми или интерстициальными. Этот метод может быть адаптирован, например, к моноцитам с антителами к Ly6C, В-клеткам с антителами к CD19.

1. Загрузите желаемое антитело в шприц объемом 3/10 куб. см с иглой 31G 5/16 дюйма, стараясь свести к минимуму количество пузырьков воздуха внутри шприца. Используйте его для внутривенного введения в НПВ на шаге 6.5.
2. Выполняйте лапаротомию в соответствии с пунктами 5.3-5.4.
3. После лапаротомии выполните правую медиальную висцеральную ротацию с помощью двух аппликаторов с заостренным ватным наконечником. У мышей это делается путем потрошения всей кишки слева от брюшной полости, что позволит хорошо видеть НПВ (см. рисунок 6А).
4. Удалите жир над IVC тупыми аппликаторами с ватным наконечником.
5. Введите раствор антитела в НПВ с помощью венепункции (см. рисунок 6B). После извлечения иглы немедленно надавите ватным тампоном на место венепункции до тех пор, пока она не станет кровоостанавливаемой (обычно около 2-3 минут).
6. Верните выпотрошенный кишечник в брюшную полость над ватным тампоном, продолжая оказывать давление на НПВ (см. рисунок 6C).
7. Выполните торакотомию раскладушки в соответствии с шагами 5.5-5.7 для забора левого легкого. Дайте антителам не менее 5 минут для системной циркуляции перед жертвоприношением и сбором урожая. Усыпьте мышь после сбора ABG и/или лечения антителами.

7. Гистологическое окрашивание (H&E)

1. После фиксации формалином и парафинообразования левого легкого и разрезания до толщины 5 мкм депарафинизируйте предметное стекло в ксилоле (два промывки по 10 минут).
2. Обезвоживайте при последовательных стирках этанолом: 2x 5 мин стирки со 100%, 1x 2 мин стирки с 95% и 1x 2 мин стирки с 70% этанолом. Затем промойте в деионизированной воде.
3. Закрасьте предметное стекло гематоксилином на 2-4 минуты, затем промойте деионизированной водой в течение 5 минут или пока оно не станет прозрачным. Точная продолжительность окрашивания гематоксилином должна быть оптимизирована в соответствии с тканями и желаемой интенсивностью ядерного окрашивания.
4. Стирать в определяющем растворе в течение 30 секунд для дифференциации пятен, затем стирать в воде в течение 2 минут. Постирать в формовочном растворе синего цвета в течение 30 с, затем постирать в воде в течение 2 минут.
5. Еще больше обезвоживайте, погрузив в 95% этанол в 15 раз. Окрашивать в эозин в течение 1 мин.
6. Обезвоживайте с помощью 2 мин промывки этанолом (2 мин), а затем 2 мин промывки ксилола (2 мин). Нанесите монтажный носитель и защитное покрытие.

Результаты

После пережатия левого прикорневого отверстия парциальное давление оксигенации в артериальной крови (PaO₂), относящееся к левому легкому, составляет ~100 мм рт.ст., что значительно ниже по сравнению с ~500 мм рт.ст. после фиктивной торакотомии (рис. 7A, n = 6-7). Следует отмети...

Обсуждение

Мы описываем технику прикорневого зажима, которая включает в себя наложение узла на левом вороте, который окклюзирует легочную артерию и вены и бронх, чтобы вызвать теплую ишемию с последующей реперфузией. После прикорневой пережатости левое легкое может быть собрано для различных эк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection